一、组合核心作用

1. SYTO9/PI：区分活菌（绿）/ 死菌（红），判定细菌膜完整性与活力
2. 荧光凝集素：特异性识别菌体表面糖基类型，实现菌种分型、表面糖基表征、菌群溯源
3. 联用效果：同时判定细菌死活状态 + 表面糖基表型，适用于菌群鉴定、抑菌机制、黏附实验、环境微生物检测

二、优选搭配组合（最常用）

三、试剂准备（复申生物现货）

1. 荧光标记凝集素：WGA-TRITC、ConA-TRITC、UEA-I-TRITC
2. 细菌死活染色试剂盒：SYTO9/PI 双染试剂盒（FS4005）
3. 基础试剂：无菌 PBS 缓冲液
4. 四、标准实验操作步骤

1. 菌液预处理

1. 对数期菌液 8000 rpm 离心 5min，弃上清
2. 无菌 PBS 洗涤 2 次，重悬调整菌浓度至 \(10^6\sim10^7\ \text{CFU/mL}\)

2. 联合染色（一步共染法，最简高效）

1. 体系配制（样本管）
   菌悬液 \(100\ \mu\text{L}\) + 荧光凝集素工作液 + SYTO9/PI 混合染液
2. 轻轻吹打混匀，室温避光孵育 20 min
3. 孵育完成后无需洗涤，直接制片镜检

3. 分步染色法（染色效果更佳）

1. 先加荧光凝集素避光孵育 15min，PBS 轻洗 1 次
2. 再加入SYTO9/PI避光孵育 15min
3. 制片观察

五、荧光判读结果

1. 仅发绿色荧光：活菌，凝集素阴性（无对应表面糖基）
2. 绿 + 橙红双荧光：活菌，凝集素阳性（菌体含特异性糖基）
3. 仅发红色荧光：死菌，无凝集素结合信号
4. 红 + 橙红双荧光：死菌，菌体仍保留特异性表面糖基

六、关键实验注意事项

1. 全程避光，荧光染料极易淬灭
2. 体系严禁添加葡萄糖、甘露糖、唾液酸等游离单糖，会阻断凝集素结合
3. 染色 pH 维持 7.0~7.4 中性环境，保证凝集素结合活性
4. 孵育时间不可过长，避免菌体非特异性吸附染料
5. 流式检测可直接上机，荧光显微镜选用 FITC 通道、TRITC 通道双通道观测

七、主流应用场景

1. 抗菌药物药效评价：观察药物致死细菌后，菌体表面糖基变化
2. 肠道菌群分型：活力状态 + 糖基表型双重鉴定
3. 细菌 - 宿主黏附实验：凝集素标记细菌，SYTO9/PI 判断黏附后细菌存活状态
4. 水体 / 食品微生物污染快速筛查
5. 益生菌活性及表面特性研究

八、推荐工作浓度

• 荧光凝集素：终浓度 10~20 μg/mL
• SYTO9：终浓度 1~2 μM
• PI：终浓度 2~4 μM