线性PEI转染稳转株慢病毒的详细操作步骤
发布日期：2026/4/13 16:53:23
线性PEI转染稳转株慢病毒的详细操作步骤
一、前期准备细胞准备：选择处于对数生长期、状态良好的目的细胞（且细胞无支原体污染），选择处于对数生长期、活力高、代次低（30代以内）的细胞，避免使用胰酶消化，建议用胶原酶。
转染前12-24小时铺板，转染时细胞汇合度达到70%-80%；对于HEK-293、HEK293T、NIH/3T3和COS细胞，可提前两天铺板并适当降低密度。
试剂与质粒准备：
慢病毒包装质粒和携带目的基因的转移质粒，确保质粒纯度高（OD260/OD280在1.8-2.0之间）。无血清培养基（如Opti-MEM），用于稀释PEI和质粒。
二、转染操作
质粒混合：按合适比例（通常转移质粒:例如psPAX2:pMD2.G = 4:3:1）取适量质粒，加入到无血清培养基中，轻轻混匀，室温静置5分钟。
PEI稀释：根据质粒总量计算PEI用量（PEI与质粒质量比常用一般为3:1），将PEI加入到另一管无血清培养基中，轻轻混匀，室温静置5分钟。
复合物形成：将稀释后的PEI逐滴加入到质粒混合液中，边加边轻轻混匀，室温静置20-30分钟，让PEI与质粒形成稳定的复合物。
转染细胞：将复合物逐滴加入到细胞培养孔中，轻轻摇晃培养板使其分布均匀，然后放入37℃、5%CO₂培养箱中培养。
换液处理：转染后6-8小时，更换为新鲜的完全培养基，减少PEI对细胞的毒性。
【注】：需要将培养板中的培养基全部弃掉，因为此时未被细胞摄取的PEI-DNA复合物仍残留在培养基中，持续接触会增加细胞毒性，影响后续细胞状态和转染效率。换液过程中用PBS建议进行1-2次清洗。
常见细胞系的转染优化建议
1. HEK-293/293T细胞
铺板密度：转染前两天铺板，适当降低密度
血清兼容性：即使在10%血清存在下，DNA-PEI复合物仍能有效转染
推荐比例：DNA与PEI质量比1:3至1:4
2. NIH/3T3细胞
铺板时间：转染前两天铺板，确保转染时汇合度70%-80%
培养基选择：建议使用无血清或低血清培养基
转染效率：通常较高，可适当降低PEI用量
3. COS细胞
铺板策略：提前两天铺板并降低密度
转染复合物：可在含血清培养基中形成复合物后转染
检测时间：转染后24小时即可检测到转染效果
4. 悬浮细胞
培养基选择：使用无血清悬浮培养基，如Freestyle 293表达培养基
培养体积：摇瓶中培养基总体积不超过培养瓶总体积的20%（500ml以下摇瓶）或30%（500ml以上摇瓶）
转染方式：直接向细胞悬液中加入DNA-PEI复合物，轻轻混匀。
慢病毒收集与浓缩
病毒收集：转染后48小时和72小时分别收集细胞上清液，用0.45μm/0.22um滤器过滤去除细胞碎片。【注】是从质粒加入细胞的转染起始时间开始算，以防过滤过程中可能会有部分病毒颗粒被滤膜吸附，导致最终病毒滴度有所下降。建议选择低蛋白结合力的滤膜材质（如PES聚醚砜、纤维素醋酸酯）
病毒浓缩（可选）：若病毒滴度较低，可采用超速离心法（25000rpm，4℃离心2小时）或PEG沉淀法浓缩病毒，用少量PBS重悬病毒沉淀。
稳转株筛选
病毒感染：将目的细胞接种到培养板中，汇合度达到30%-40%时，加入适量慢病毒原液或浓缩液，同时加入8μg/ml的Polybrene（CAT:#FS1151）促进病毒感染，培养24小时后更换新鲜培养基。
抗性筛选：感染后48小时，加入对应的抗性筛选药物（如嘌呤霉素CAT:#FS0020、潮霉素CAT:#FS0012），根据细胞耐药性调整药物浓度，每2-3天更换一次含药培养基，持续筛选7-14天，直至未感染的细胞全部死亡。
单克隆化：筛选后存活的细胞采用有限稀释法或流式细胞分选法进行单克隆化，得到单一细胞来源的稳转株。
鉴定验证：通过PCR、Western Blot或荧光检测等方法，验证目的基因是否稳定整合到细胞基因组并表达。
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