嘌呤霉素盐酸盐

产品简介

嘌呤霉素（Puromycin，CAS：58-58-2），来源于白黑链霉菌（Streptomyces alboniger）代谢产物的一种氨基糖苷类抗生素，有效抑制革兰氏阳性菌生长，对抗酸杆菌的抑制活性相对较弱，但对革兰氏阴性菌的抑制活性更弱。还能抑制原生生物、藻类、哺乳动物和昆虫细胞的生长，一般2天内能杀死99%的细胞。作用机制（Mode of action）：嘌呤霉素作为氨酰-tRNA分子3’末端的结构类似物，能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸肽链中，导致肽链合成的永久终止，进而阻止蛋白质合成。抗性产生机制（Mode of resistance）：对嘌呤霉素的抗性来自嘌呤霉素产生菌内发现的pac基因，其表达产物嘌呤霉素N-乙酰转移酶（puromycin N-acetyl-transferase）可通过乙酰化嘌呤霉素使其失活。这一特性使得嘌呤霉素常用来基因筛选，用来筛选和维持培养携带pac基因质粒/载体的瞬转或稳转哺乳动物细胞株，特别是慢病毒颗粒感染的细胞株；也用在CRISPR/Cas9基因编辑系统中液发挥重要作用。

通常均为粉剂形式提供，FS0020R-1ml为配制好的10mg/ml的水溶液经0.22 μm滤膜过滤除菌形式提供。

产品特性

1） 化学名：3'-[α-Amino-p-methoxyhydrocinnamamido]-3'-deoxy-N,N-dimethyladenosine dihydrochloride

2）同义名：Stylomycin hydrochloride; CL 13900 dihydrochloride; P638 dihydrochloride; CL16536; NSC 3055;

3）CAS NO：58-58-2

4）分子式：C₂₂H₂₉N₇O₅·₂HCl

5）分子量：544.43 g/mol

6）外观：白色至灰白色粉末

7）纯度：＞98% (HPLC)

8）熔点：175-177 °C

9）溶解性：溶于水（50mg/ml），乙醇（~1mg/ml），DMSO（~10mg/ml），PBS，pH 7.2（~10mg/ml）

10)储存条件 : -20℃，4年有效。                          

使用方法

用蒸馏水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/ml的母液，经0.22 μm滤膜过滤除菌后分装于-20℃冻存；也可溶于甲醇，配制成10 mg/ml的储存液。

常见筛选浓度： 

哺乳动物细胞：1-10 μg/ml，最佳浓度使用宿主细胞杀灭实验（杀灭曲线）来确定；

大肠杆菌：LB琼脂培养基筛选敏感转化菌株，使用浓度为100-125μg/ml。

以下是针对一些哺乳动物细胞的筛选浓度：

为了筛选到稳定表达待研究shRNA的细胞株，确定杀死未转染/转导细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。所以初次做实验的客户一定要建立适合自己体系的杀死曲线（kill curve） 。

（1）24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。细胞孵育过夜；

（2）准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）；

（3）细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞；

（4）约2-3天更换新鲜的筛选培养基；

（5）每日监测细胞观察存活细胞比例。嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。

（6）最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。

►嘌呤霉素筛选稳定转染细胞

（1）day 0：24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，孵育过夜；

（2）制备筛选培养基：含有最佳筛选浓度嘌呤霉素（由杀灭曲线确定）的新鲜培养基；

（3）day 1：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI的病毒颗粒；（加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。）

（4）病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基（血清和双抗，如果已经使用双抗。）到细胞内，然后孵育过夜；

（5）病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。孵育。

（6）约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基；

（7）每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及turboGFP表达的水平及所占比例。在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。

{注意}：病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。在做嘌呤霉素筛选时，需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞，但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。

注意事项

1) 嘌呤霉素为有毒化合物，操作时需注意防护，切勿与身体或皮肤直接接触，

2) 为了您的安全与健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

常用筛选抗生素及其使用浓度

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