G-418; G418二硫酸盐; 遗传霉素

产品简介

  G-418是一种由小单孢菌NRRL5326菌株产生的氨基糖苷类抗生素，它在体内和体外均具有广谱的抗菌活性。G-418通过抑制转座子Tn61，Tn5的基因，干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成。G-418对于蛋白合成的抑制是在延伸的早期阶段、起始后、翻译起始阶段以及翻译将要起始的阶段之前。此外，它可对原核和真核等细胞产生毒素，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。

哺乳动物细胞中，当抗性基因neo整合进入真核细胞基因组，使其能编码氨基糖苷磷酸转移酶3’[I](APH 3’[II])，此酶通过共价修饰G418的氨基或羟基功能，抑制抗生素-核糖体间的相互作用，从而使得抗生素失活。这一特性赋予细胞产生G418抗性。

植物细胞中，当抗性基因nptII导入细胞内，其也能编码氨基糖苷磷酸转移酶，从而使得多种抗生素丧失活性，包括G418，卡那霉素和巴龙霉素。

我司提供两种形式的G418硫酸盐：

①一种以冻干粉形式提供(货号:FS0019-1G，FS0019-5G)，易溶于水(50mg/mL)。需过滤除菌后使用。

②一种以溶于水的储存液形式提供(货号:FS0019R-20ML)，无菌溶液，可直接使用。对于基因筛选实验，需要建立杀灭曲线(剂量反应曲线)确定能够杀死无抗性细胞的最低有效浓度。

产品组成

产品特性

CAS :108321-42-2

同义名:G-418;G418;Antibiotic G418 sulfate; G 418 disulfate salt; Geneticin; Glycoside-418, Sulfate; BRN 1669188; G418硫酸盐;G-418硫酸盐;G418二硫酸盐;遗传霉素;

分子式:C₂₀H₄₀N₄O₁₀·₂H₂SO₄

分子量:692.7

外观:白色至类白色粉末

纯度:≥98%(HPLC)

活性:≥700 μg/mg(基于干重)

储存及运输条件 : -20℃，4年有效。蓝冰运输

使用方法

一、G418储存液的制备

1)活力单位的换算

公式:(1000/A0)xA1=A2，其中A0是G418的活力值(Potency)，因批次而异。可见批次对应的质检报告，或者瓶子上的标签。A1是想配制的G418活性浓度。A2是实际称重的粉末与体积比浓度。

示例:若所用批次的G418活力值为:720μg/mg，要配制50mg/mL的G418活性浓度，则实际要配制的粉末浓度为1000/720x50 mg/ml=69.44 mg/mL。

如果配制10ml的G418储存液(活性浓度，50 mg/ml)，则需要称取694.4mg粉末。

2)除菌和保存

根据上述换算得到的实际粉末称重，加入10ml去离子水内使其完全溶解。先用5ml去离子水预湿润0.22μm针头式过滤器，除尽水。之后使用此滤器过滤，除菌后分装成单次使用的小量(如1ml)放到-20C冻存，2年稳定。

【注意]:①不要对混浊的溶液进行过滤，因为混浊的溶液意味着未完全溶解，过滤过程中会造成药物损失，降低终液的活性。②不建议使用液体培养基，NaCI，磷酸盐溶液或者有机溶剂来制备储存液。

1.2 对于G418储存液(货号:FS0019R-20ML)

本品是基干G418活性浓度配制的无菌溶液，活性浓度为50ma/mL，收到货第一次使用，可将本品按照更小规格分装，-20°C保存，以延长本品的保存周期。若使用频繁，可将本品置于2-8C保存，至少1年稳定。

二、 常用筛选浓度

一般来说，刚开始筛选转化子需要高浓度的G418，并用一个较低浓度的G418用于维持培养。生长条件，细胞类型和其他的环境因素都可能影响G418的用量，因此第一次使用的实验体系建议通过杀灭曲线(kill curve)，即剂量反应性曲线，来确定最佳筛选浓度。通常情况，哺乳动物细胞筛选范围200-2000μg/mL;植物细胞:10-100μg/mL;酵母细胞:500-1000μg/mL;网柄菌属:10-100μg/mL;

以下是一些细胞类型使用G418筛选使用的浓度，可做参考。

三、杀灭曲线的建立

为了筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞株，需要确定能够杀死未转染宿主细胞的抗生素最低浓度，可通过建立杀灭曲线(剂量反应曲线)来实现，至少选择6个浓度。处理分裂期的细胞时G418的活性最强，因此在添加G418之前需要让细胞培养一段时间。

3.1 第一天:未转化的细胞按照20-25%的细胞密度铺在合适的培养板上，37℃，CO2培养过夜;[注意]:对于需要更高密度来检测活力的细胞，可增加接种量。

3.2 根据细胞类型，设定合适范围内的浓度梯度。以哺乳动物细胞为例，可设定0，50，100，200，400，800，1000 μg/mL。

3.3 第二天:去除旧的培养基，换用新鲜配制的含有相应浓度药物的培养基。每个浓度做三个平行孔。

3.4 接下来每3-4天更换新的含药物培养基。

3.5 按照固定的周期(如每2天)进行活细胞计数来确定阻止未转染细胞生长的恰当浓度。选择在理想的天数(通常是7-10天)内能够杀死绝大多数细胞的最低浓度为稳定转染细胞筛选用的工作浓度。

四、稳定转染细胞的筛选

4.1 转染48h后，用含有适当浓度的G418筛选培养基来传代细胞(直接传代或者稀释后传代)。

[注]:细胞处于活跃分裂状态时抗生素的杀伤效果最好。当细胞过于稠密，其效率会降低。为了得到较好的筛选效果，最好将细胞稀释至丰度不超过25%.

4.2 每隔3-4天更换含有药物的筛选培养基。

4.3 筛选7天后观察并评估细胞克隆(集落)的形成情况。集落的形成可能还需要一周或者更多的时间，这取决于宿主细胞类型，转染，以及筛选效果，

4.4 挑取并转移5-10个抗性克隆于35mm细胞培养板，继续用含药物的筛选培养液维持培养7天。

4.5 之后更换正常培养基培养即可。

注意事项

1) 不要将G418和其他抗生素/抗真菌剂(如青霉素/链霉素)共同使用，因为这些抗生素是G418的竞争性抑制剂。其他抗生素也有可能产生交叉反应。

2) 本品以粉末形式提供，非无菌的。因此，配制的溶液需经0.2μm滤膜过滤除菌后再使用。不可高压灭菌。G418储存液置于-20℃可稳定保存高达24个月，或置于2-8C稳定保存高达6个月。

3) 配制G418溶液，一定要根据G418实际批次的活性(potency)来进行换算，从而得到需要活性浓度的储存液以及工作液。

4) G418溶于水是呈酸性的，直接加入培养基通常会导致瞬间的pH变化，在含酚红的培养基内会看容易看到颜色变化。如果培养基本身具有良好的缓冲性，经几分钟至数小时pH会回复到正常。如果pH变化是很看重的一个因素，可选择用缓冲液溶液比如100mM HEPES来配制G418储存液。

5) G418加入培养体系中未转染的细胞有可能不会被杀死，原因在于药物浓度过低，或者细胞密度过高。另外，快速分裂的细胞相对于缓慢增殖细胞，更容易被杀死。对照细胞(未转染)可能抗生素添加5-7天后才能杀死，转染细胞(抗性克隆子)的克隆需要10-14天形成。

6) 即使加入杀死剂量的G418，细胞可能会继续分裂2-3次。G418的药效通常在2天后才变得明显。

7) 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

常用筛选抗生素及其使用浓度

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