Reverse Transcription reagent Kit（M-MLV）cDNA制备反转录试剂盒

产品简介

本产品中 M-MLV（莫洛尼鼠白血病病毒）逆转录酶是通过基因重组技术克隆表达的一种重组 DNA 聚合酶,可从单链 RNA，DNA 或 RNA：DNA 杂合体合成互补的 DNA 链。与 AMV 相比，M-MLV 缺乏 DNA 核酸内切酶活性，而 RNase H 活性较低。M-MLV 在 37°C 时具有最佳活性,延伸能力强，可用于合成最大 7 kb 的 cDNA。

本产品以最恰当比例混合的 Primer 混合液，对于不同长度的目标片段，只需要 15-20 分钟就能够对目标片段进行高效率的逆转录反应。

本产品所含成分对于 Real-time PCR 反应体系无影响，反应曲线表现良好。

产品组成

储存及运输条件：-20℃保存；干冰运输。

质量控制:经检测无外源核酸酶活性。

※活性定义：以 Poly（A）﹒Oligo（dT）为模板/引物，在 37℃、10 分钟条件下，掺入 1 nmol 的 [3H] dTTP 所需要的酶量定义为 1 个活性单位（U）。

※活性检测条件：50 mM Tris-HCl (pH 8.3)，40 mM KCl, 6 mM MgCl2， 1 mM DTT，0.5 mM [3H]dTTP,，0.1 mM poly(A),，0.1 mM oligo(dT)12-18,，0.1 mg/ml BSA,，M-MLV，Total volume 50 µl ，10 min at 37°C 。

使用方法

1. 去除基因组 DNA 反应。

去除 RNA 溶液中的基因组 DNA，可参考使用本公司产品 Recombinant DNase I（Cat.#FS0359）;若确定所用 RNA 已去除基因组 DNA,则直接进行下一步。

2. RNA 的变性。

把 RNA 在 65℃条件下进行温浴 5 分钟，立即置于冰上冷却。

[注]：温浴对于容易形成高级结构的 RNA 可以提高逆转录的效率。

立即置于冰上冷却防止 RNA 缓慢冷却时复性，重新形成高级结构。

温浴时请勿加入酶和 5xReaction Buffer

3. 逆转录体系的配制。

按如下成分于冰上配制反应混合液，为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按

反应数+2 的量配制 Master Mix，然后再分装到每个反应管中，最后加入 RNA 样品。 

[注]：配置体系混匀后简短离心，以使反应液集中于反应管底。

反应体系可按需求相应放大。

Random 和 Oligo（dT）Primer 同时使用，可有效地将全长 mRNA 反转录成 cDNA。

使用单引物进行反转录时，建议 10μǀ体系使用量分别为：

Random Primer           50pmol,

Oligo（dT）Primer       25pmol,

Gene specific primer      1pmol。

4. 逆转录反应。 

在 37℃条件下，进行 15 min 的逆转录反应。

在使用基因特异性引物的情况下，特别是使用相同序列的逆转录引物和 PCR 引物的时候，在逆转录反应时的非特异性退火是导致 PCR 非特异性扩增产物产生的原因。此时，提高逆转录反应的温度至 50-55℃可得到改善。

5. 逆转录酶的失活。 

在 85℃条件下，进行 5 sec 的酶失活反应。

反应结束之后，请于 4℃或者 -20℃条件下保存。在进行后续的 Realtime PCR 反应时，根据实际进行反应液的添加，添加体积一般不应超过 PCR 反应体系的 20%。过量的添加逆转录反应液，会降低 PCR 的反应效率，不能进行准确的定量。

五、注意事项

1)分取试剂时务必使用新的枪头（Tip），以防止样品间污染，同时，要使用精确、量程适合的移液枪。

2)当同时需要进行数次反应时，应先配制各种试剂的混合液，然后再分装到每个反应管中，可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，同时也可以减少实验操作或实验之间产生的误差。

3)为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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