Cholera Toxin B subunit 霍乱毒素B亚基

产品简介

霍乱毒素B亚单位(Cholera Toxin Subunit B，简称CTB)是霍乱肠毒素的重要组成部分，而霍乱肠毒素是霍乱弧菌分泌的主要致病因子。天然霍乱毒素采用AB5毒素结构模式，由一个具有酶活性的A亚单位和五个相同的B亚单位非共价结合形成的环状五聚体。该产品为重组形式，通过基因工程技术单独表达B亚单位，完全不含具有毒性的A亚单位，既保证了实验安全性，又不影响其功能特性。

CTB的核心功能机制在于其能够特异性识别和结合细胞膜上的GM1神经节苷脂(monosialotetrahexosylganglioside)。GM1神经节苷脂是一种广泛分布于真核细胞膜上的糖鞘脂，特别在神经元胞体、树突以及上皮细胞表面富集。CTB与GM1的结合具有高度亲和力和特异性，这种结合特性是其多种应用场景的分子基础。CTB可以在不引起细胞毒性反应的前提下，利用CTB的膜结合能力进行多种研究。

产品应用：神经元逆行示踪剂、免疫佐剂、标记细胞膜上的脂筏

CTB是公认的强效黏膜免疫佐剂。其作用机制在于：CTB结合黏膜上皮细胞表面的GM1后，能够促进共价或非共价偶联的抗原被上皮下免疫细胞（如M细胞、树突状细胞）摄取和呈递，同时诱导黏膜局部产生IL-4、IL-10等Th2型细胞因子，从而显著增强黏膜IgA抗体应答和系统性体液免疫。基于此特性，CTB已被广泛应用于口服、鼻腔或舌下途径的疫苗递送研究，能够有效提高抗原的免疫原性，且安全性优于完整的霍乱毒素（CT）。

起初CTB作为非荧光示踪剂被应用于逆行示踪技术中，荧光结合形式CTB的出现让其逐渐转变为一种常用的荧光示踪剂，如FITC-CTB(#FS1488)是用异硫氰基荧光素（FITC）标记的CTB产品。此外，我们还可以定制AF488/AF594/AF647等小分子荧光素标记的CTB。

产品特性

CAS：131096-89-4

中文名称:荧光素标记的霍乱毒素B亚基;异硫氰酸荧光素标记的霍乱毒素B亚基

英文名:Fluorescein CTB,FITC CTB,Fluorescein Cholera Toxin Subunit B,FITC Cholera Toxin Subunit B，CTxB、Choleragenoid

分子量：11.8kDa(还原)

形式：重组型

外观：粉末

叠氮化钠：未添加

内毒素：＜0.2EU /μg

纯度：经 SDS-PAGE和RP-HPLC检测，纯度＞95%

储存及运输条件：固体粉末，-20℃储存，有效期5年。使用前用无菌1×PBS（PH7.4）溶解成1 mg/mL的储存液，分装后于-20至- 80°C 保存，有效期 6 个月。 2-8°C 保存，有效期 1 周。避免反复冻融。

使用方法

一、神经元逆行示踪剂

1.1、CTB试剂配制与储存

使用前取1mg CTB粉末，加入100μL无菌1×PBS（PH7.4），轻柔涡旋混匀，避免剧烈震荡（防止蛋白结构破坏），配置成10 mg/mL（或配制1% CTB溶液 w:v）的储存液，于-20至- 80°C分装保存，避免反复冻融。

1.2、动物手术与CTB注射

立体定位：将动物头部固定于立体定位仪上。

注射位点：目标核团（以CSF-contact nucleus为例），需提前根据脑图谱确定精确的三维坐标。

注射体积：0.2 μL。

注射浓度：1% CTB溶液。

注射工具：使用Hamilton微量注射器（33G针头） 连接微量注射泵进行控制。

注射速度：缓慢注射，全程约30分钟。

针头停留：注射完成后，针头在原位停留 10-15分钟，然后缓慢退出，以减少溶液沿针道回流。

1.3、灌注取脑与切片

存活期：注射后让动物存活 7-10天，以保证CTB被神经元充分摄取并逆向运输至胞体。

灌注固定：再次麻醉动物。先经心脏灌注 300 mL 预冷的 1×PBS（PH7.4）冲洗血液。紧接着灌注300 mL 4% 多聚甲醛（溶于1×PBS，pH 7.4） 进行固定。

取脑与切片：取出完整脑和脊髓，在冷冻切片机上进行冠状切片，片厚40 μm。收集切片于PBS或防冻液中备用。

1.4、免疫荧光染色

封闭与通透：使用含 0.3% Triton X-100的1×PBS（PH7.4）作为抗体稀释液和洗涤液，以通透细胞膜并减少非特异性结合。

一抗孵育：将脑片在4°C下孵育 48小时。

二抗孵育：用荧光标记的二抗，将脑片在室温下避光孵育 2小时。

细胞核复染：使用 DAPI 对细胞核进行染色，便于定位。

封片与观察：甘油封片，在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察。CTB阳性信号为绿色荧光（FITC）。

1.5、图像采集与分析

采集：使用10×物镜观察并定位阳性神经元分布区域，使用40×物镜观察神经元细节形态。

分析：使用Image-Pro Plus等软件定量分析特定脑区内CTB阳性神经元的密度（个/0.2 mm²）。

三维重建：可将阳性神经元的位置信息在标准脑图谱上配准，使用Imaris等软件进行三维可视化重建。

二、免疫佐剂

2.1、溶液配置：使用前取 CTB粉末，缓慢加入1×PBS（PH7.4） ，轻柔涡旋混匀，避免剧烈震荡（防止蛋白结构破坏），配置成1mg/mL储存液，于-20至- 80°C 分装保存，正式实验前再用PBS稀释。

2.2、佐剂-抗原比例：可根据不同抗原类型调整，核心原则为 “佐剂剂量不超过抗原剂量的1倍”（需预实验优化比例，混合溶液建议现配现用）。

2.3、使用浓度与剂量（以口服免疫为例）：单只小鼠单次剂量：10μg /只（文献报道与 15μg HA 的 H9N2 WIV 联合免疫）。按 100μL/只 给药体积计算，CTB 终浓度为 100μg/mL。免疫间隔：0 天、7 天、14 天（共 3 次免疫）。

三、脂筏标记

细胞膜脂筏的标记可以直接使用CTB-FITC（#FS1488，1mg/mL）进行标记，方法如下：

以下方案适用于对 1 个 2 mL 体系、浓度为 1×10⁶个/mL 的悬浮活细胞样本进行标记。对于在 18 mm×18 mm 盖玻片上生长至亚汇合度（70%-80%）的贴壁细胞，也可使用相同体积的试剂进行标记。若需标记多个样本，可按比例扩大试剂用量；若孵育体积小于 2 mL，可按比例减少试剂用量。

3.1、细胞洗涤：将细胞离心，用预冷的1×PBS（PH7.4）轻轻重悬细胞沉淀。

3.2、CTB孵育条件

浓度优化：CTB-FITC（#FS1488，1mg/mL）推荐工作浓度5-10μg/mL（不同细胞类型最适浓度有差异，需预实验确定，过高浓度增加背景），工作液可用无菌1×PBS稀释（PH7.4）。

孵育时间与温度：4°C孵育30分钟（减少内吞作用，保持膜表面GM1标记）。若需标记内化GM1，可改为 37°C孵育15-30分钟。孵育结束后，用预冷的1×PBS（PH7.4）轻轻洗涤细胞数次。

避光操作：CTB-FITC对光敏感，全程避光。

3.3、封片与观察标记细胞

若细胞无需用醛类固定以进行长期储存，也无需固定后用去污剂透化以进行后续标记步骤，则可直接进行此步骤；否则跳过此步骤，继续进行步骤 3.4。将细胞置于预冷的1×PBS（PH7.4）中封片，使用合适的滤光片组通过荧光显微镜观察细胞。

3.4、固定（可选）：将细胞置于含 4% 甲醛的预冷1×PBS（PH7.4）中，在 4°C 条件下固定 15 分钟，避免醛类过度交联破坏脂筏结构。甲醇/丙酮等有机溶剂固定会溶解脂筏，不可使用。若细胞无需去污剂透化，可直接进行步骤3.6。

洗涤：固定后用1×PBS（PH7.4）轻柔洗涤3次，防止脂筏破坏。

3.5、透化细胞（可选）：脂筏的标记不建议透化处理，如实验中无法避免透化，可尝试将固定后的细胞置于含 0.1% Saponin的1×PBS（PH7.4）中，在室温下透化 10 分钟。透化结束后，用 1× PBS 洗涤细胞 1 次。

3.6、封片与观察固定后的细胞：使用适宜的封片剂（如#FSM0032）对固定后的细胞（或固定并透化后的细胞）进行封片，然后使用合适的滤光片组通过荧光显微镜观察细胞。

注意事项

1）荧光染料都存在淬灭问题，操作或保存过程中尽量避光，减缓荧光淬灭。

2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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