Liperfluo 脂质过氧化荧光探针

产品简介

Liperfluo是Spy-LHP的类似物，可用于检测脂质过氧化物 (LPO)，Liperfluo会被脂质过氧化物特异性氧化而在乙醇等有机溶剂中发出很强的荧光。由于氧化型Liperfluo的激发和发射波长分别为Ex:524 nm和535 nm (均为长波长)，因此可以减轻光对测定样品的损伤和降低样品的自发荧光。由于Liperfluo在二异喹啉环的一个末端连接有四乙二醇基团，因此提高了它在水溶液中的分子分散性。虽然它的氧化型在水溶液中几乎没有荧光，但是在细胞膜等脂溶性高的部位会产生较强的荧光。因此Liperfluo适用于活细胞中脂质过氧化物的荧光成像或流式分析,激发波长Ex：488 nm，发射波长Em：500-550 nm的长波长激发，可以减少光损伤和自发荧光对细胞的影响;因此Liperfluo比BODIPY C11更适合于胞内定位。

运输与保存方法:冰袋运输。-20℃避光干燥保存， 1年有效。

产品特性

CAS：1448846-35-2

分子量：C₅₁H₄₁N₂O₈P

外观：深红色结晶粉末或固体。

纯度（HPLC）：≥90.0%

Ex/Em:488/500～550 nm

溶解性：溶于DMSO

使用方法

1. 储存液的配制
1.1）本品是以冻干粉末形式提供，使用前需将本品回温至室温。

1.2）之后使用细胞培养级别的无水DMSO（货号：CAT:#FS0306）将其充分溶解至终浓度1 mM。(本品M. Wt.= 840.85 g/mol，换算下来，50 µg粉末只需加入60µL DMSO即可得到1 mM储存液)。[注意1]：如果溶解过程中试管底部有固体，可涡旋混合约2～3分钟。

1.3）可根据单次的使用量将储存液分装后放到-20℃避光，避免反复冻融。

[注意2]：Liperfluo储备溶液免受光照建议配好后的在一天内使用完。

2. 工作液的配制(Liperfluo的最佳染色会根据实验条件方法不同而变化。请参考以下步骤操作。)

2.1).用于显微镜成像：用无血清细胞培养基稀释1 mM的Liperfluo储存液。

2.2).用于流式细胞术：将1 mM的Liperfluo储备溶液直接加入细胞悬浮液中。

3. 制备、标记和成像细胞

3.1). 制备细胞在培养皿或孔板中接种细胞

3.2). 去除上清液细胞培养基，并用无血清培养基清洗细胞1-2次。

3.3). 向细胞中加入适量的Liperfluo工作溶液，并在37°C下孵育30分钟。

[注意]：优化Liperfluo的最终浓度，因为最佳浓度取决于实验条件和其他因素。

3.4). 使用激发波长为488nm，发射波长为500-550nm的荧光显微镜或流式仪观察或分析细胞。

案例①用共聚焦荧光显微镜观察HeLa细胞(先加Liperfluo→再加药)源自参考文献

a. HeLa cells in MEM (containing 10% fetal bovine serum) were seeded (3.0x104 cells/well) in a 8 well2.

slide (ibidi) and cultured overnight at 37℃ in a 5% CO, incubator.

b. Removed the superatant and the cells were washed with serum-free culture medium once.D.

c. Serum-free culture medium (200 yl) containing 1 umol/L Liperfluo was added to well and the cellswere incubated at 37℃ for 30 minutes in a 5% CO, incubator.

d. The medium was removed and the cells were washed with 200 ul of HBSS twice.

e. HBSS (200 yl) containing 500 umol/Lt-BHP (tert-buthyl hydroperoxide) was added to the well andthe cells were incubated for 60 minutes at 37℃ in a 5% CO, incubator.

f. The cells were observed under a confocal fluorescence microscope. (Ex: 488 nm, Em: 500-550 nm).

 案例②用流式细胞仪检测HeLa细胞(源自文献)

a. HeLa cells in MEM (containing 10% fetal bovine serum) were seeded (1.0x10⁵cells/well) in a 6 wellplate (Thermo) and cultured overnight at 37℃ in a 5% CO₂, incubator.

b. Removed the supernatant and the cells were washed with serum-free culture medium once.

c. Serum-free culture medium (2 ml) containing 1 umol/L Liperfluo was added to well and the cellswere incubated at 37℃for 30 minutes in a 5% CO₂, incubator.

d. The medium was removed and the cells were washed with 2 ml of HBSS twice.

e. HBSS (2 ml) containing 500 umol/L t-BHP (tert-buthyl hydroperoxide) was added to the well, ande.

the cells were incubated for 60 minutes at 37℃in a 5% CO₂, incubator.

f. The cells were harvested by trypsinization and collected into a microtube with culture medium.

g. The supernatant was replaced with HBSS and the cells were analyzed using a flow cytometerg(Ex: 488 nm, Em: 515-545 nm).

注意事项

1）荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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常见问题Q&A

Q1.文献实验方法：先加Liperfluo，后加药；说明书实验方法：先加药，后加探针， 哪种方法比较好？

A1: 都可以。

 案例①用共聚焦荧光显微镜观察HeLa细胞(先加Liperfluo→再加药)

（1）在μ-slide 8孔板中（ibidi公司）接种HeLa细胞（3.0×10⁴个/孔、含血清MEM培养基），在37℃ 5%的CO₂培养箱中过夜培养。

（2）去除培养基，用无血清MEM培养基清洗细胞一次。

（3）将200 μl无血清MEM培养基稀释后的1 μmol/l的Liperfluo溶液加入8孔板中，在37℃ 5%的CO₂培养箱中培养30 min。

（4）去除溶液，用200 μl HBSS清洗2次。

（5）均匀地加入200 μl用HBSS稀释的500 μmol/l的t-BHP(tert-Buthyl Hydroperoxide) 溶液，在37℃ 5%的CO₂培养箱中培养60 min。

（6）用共焦荧光显微镜观察 (激发波长：488 nm，发射波长：500-550 nm)。

案例②用共聚焦荧光显微镜观察HeLa细胞(先加药→再加Liperfluo)

（1）在 μ-slide 8孔板中 (ibidi公司) 接种A549细胞 (1.0×105个/孔、含血清DMEM培养基)， 在37℃ 5%的CO2培养箱中过夜培养。

（2）去除培养基，加入200 μl用无血清DMEM培养基稀释的50 μmol/l的Erastin溶液，在37℃ 5%的CO2培养箱中过夜培养。

（3）去除培养基，用200 μl HBSS清洗2次。

（4）去除HBSS，加入200 μl用HBSS稀释的1 μmol/l的Liperfluo溶液，在37℃ 5%的CO2培养箱中培养30 min。

（5）去除溶液，用200 μl HBSS清洗2次。

（6）用激光共焦荧光显微镜观察 (激发波长：488 nm，发射波长：500-550 nm)。

Q2. Liperfluo如果按照文献进行，先加探针，后加药，荧光淬灭时间为2小时可能无法满足实验，希望延长荧光时间，是否有好的方法？或者是否可以加荧光防淬灭剂？

A2: 关于荧光抗淬灭剂：由于抗淬灭剂的作用原理，有可能无法在实验中使用。

建议及改善方法：

(1)如果褪色的原因是由光源照射造成的褪色。可以尝试减小光源强度进行观测。              

(2)清洗操作后长时间放置可能会造成探针向细胞外漏出。可考虑不清洗直接观察。

Q3.Liperfluo由于是活细胞荧光探针，如果铁死亡发生，导致细胞膜破裂后，荧光是否存在？

A3:由于Liperfluo是活细胞探针，对死细胞无法发挥出探针的正常性能。

Q4：培养基中酚红或血清对实验有没有影响？此外，在背景高或荧光弱的情况下有没有改善意见？         

A4:可用于酚红或含血清培养基。但是，如果背景高，请用PBS替换。

[注意]此外，当背景较高时，Liperfluo可能会被光自然氧化，培养时也请尽量遮光。

 (溶解后请务必用铝箔等遮光)。

荧光强度弱的情况下，即使反应时间延长，背景也会变高，所以不推荐。因此，建议调整设备 (荧光观察)的条件。

1.增强激发光的强度。

2.延长曝光时间。

Q5：悬浮和贴壁细胞都可以使用Liperfluo染色吗？是否可以染色固定细胞

A5:悬浮和贴壁细胞，都可以使用。固定的细胞不能染色。