活性氧检测试剂盒(CM-H2DCFDA)

产品简介

本款试剂盒是活性氧检测试剂盒(CAT:#FS1176S)的升级产品。活性氧检测试剂盒(CAT:#FS1176S)是一种利用荧光探针DCFH-DA(即H2DCFDA)进行活性氧检测的试剂盒，而CM-H2DCFDA是H2DCFDA的氯甲基衍生物(Chloromethyl derivative)，也称CM-DCFH-DA(CAT:#FS1399)，其在活细胞中比H2DCFDA具有更好的滞留率，因此荧光信号更强，且更适合细胞内活性氧的相对较长时间的研究。CM-H2DCFDA(CAT:#FS1399)本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成CM-H2DCF (也可称为CM-DCFH)。而CM-H2DCF不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内[1-2]。CM-H2DCF(CAT:#FS1399)的氯甲基可与细胞内谷胱甘肽或其它巯基发生反应从而具有更好的细胞内滞留性，后续细胞内的活性氧可以氧化无荧光的CM-H2DCF生成有荧光的CM-DCF [3-6]，检测CM-DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。

本试剂盒包含活性氧阳性对照Rosup，利于活性氧的检测。Rosup是一种混合物，浓度为50mg/ml。因检测对象和反应体系的不同，6孔板每孔检测体系的体积为1ml时，分别可以检测20次和100次；96孔板每孔检测体系为100μl时，分别可以检测200次和1000次。如果用于流式细胞仪，每个样品检测体系体积为0.5ml时，分别可以检测40次和200次。

产品组成：

 组分编号        组分名称                                               规格               储存方法

 FS1399S-A 活性氧探针DCFH-DA（10mM）               20ul/100ul    -20℃避光保存

 FS11399S-B 活性氧阳性对照（Rosup, 50mg/ml）     20ul/100ul     -20℃保存

保存与运输方法：-20ºC保存，有效期一年。运输：冰袋运输。

使用方法

1. 装载探针

【注意】：对于刺激时间较短（通常2h以内）的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照Rosup和/或待研究药物刺激细胞；对于刺激时间较长（通常6h以上）的细胞，先用活性氧阳性对照Rosup或待研究药物刺激细胞，后装载探针。

1.1 原位装载探针（仅适用于贴壁细胞）

1）检测前一天进行细胞铺板，确保活性氧检测当天细胞汇合率达到50~70%。

2）吸出细胞培养液，加入适量体积以及浓度的待研究药物，于37ºC细胞培养箱内孵育，具体诱导时间根据细胞类型和药物自身特性决定。

【可选】阳性对照Rosup：先用无血清培养液按照1:1000比例稀释阳性对照，通常37℃培养箱内刺激20~30min可以观察到显著的活性氧水平提高，但依细胞类型会有比较明显差异【刺激时间可参考文献或实验经验来调整】。如果刺激后30min内未观察到活性氧水平升高，可以适当提高Rosup的工作浓度；反之，如果活性氧升高过快，则适当降低Rosup的工作浓度。

3）按照1:1000用无血清培养液稀释CM-H2DCFDA（10mM），使其终浓度为10μM.。吸出细胞培养液，加入适当体积CM-H2DCFDA工作液。【注意】：加入体积以能充分盖住细胞为宜。对于6孔板，每个孔加入CM-DCFH-DA工作液不少于1ml。对于96孔板，每个孔加入CM-DCFH-DA工作液不少于0.1ml。

4）37ºC细胞培养箱内孵育20min。

5）用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的CM-DCFH-DA。

1.2 收集细胞后装载探针

1）按照常规方法，清洗并收集足量的细胞。【注意】：保证细胞的状态健康。

2）用适量体积以及浓度的待研究药物重新悬浮细胞，于37ºC细胞培养箱内孵育，具体诱导时间根据细胞类型和药物自身特性决定。【可选】阳性对照Rosup：先用无血清培养液按照1:1000比例稀释阳性对照，通常37℃培养箱内刺激20~30min可以观察到显著的活性氧水平提高，但依细胞类型会有比较明显差异【刺激时间可参考文献或实验经验来调整】。如果刺激后30min内未观察到活性氧水平升高，可以适当提高Rosup的工作浓度；反之，如果活性氧升高过快，则适当降低Rosup的工作浓度。

3）探针装载前，按照1:1000用无血清培养液稀释CM-DCFH-DA（10mM），使其终浓度为10μM.。

4）离心，吸出细胞内刺激药物，之后用适量CM-DCFH-DA工作液重悬细胞，使得细胞密度为1×106~2×107/ml。【注意】：细胞密度需根据后续检测体系，检测方法，以及检测总量来调整。例如，对于流式分析，单管检测内细胞数目控制在104~ 106之间。

5）37ºC细胞培养箱内孵育20min。每隔3~5min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。

6）用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的CM-DCFH-DA。

2. 检测

2.1 原位装载法

可用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。

2.2 收集细胞后装载法

可用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，也可用激光共聚焦显微镜直接观察。

3. 参数设置

使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可用FITC的参数设置检测DCF。

4. 其他说明

1）对于某些细胞，若发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1:2000～1:5000稀释CM-DCFH-DA，使CM-DCFH-DA的工作浓度为2～5μM。探针装载时间也可依情况在15～60min内适当进行调整。

2）Rosup仅仅用于作为阳性对照的样品，并不是在每个样品中都需加入Rosup阳性对照。

注意事项

1）探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

2）探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。

3）尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。

4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。