蛋白A/G磁珠IP试剂盒

产品简介

rProtein A/G Magnetic IP/Co-IP Kit 是一款能够高效完成免疫沉淀（IP）及免疫共沉淀（Co-IP）实验的试剂盒。其包含高性能 rProtein A/G MagPoly Beads，能够实现快速便捷的磁性分离。另外试剂盒内经过优化的缓冲液，为免疫沉淀实验提供了良好的反应条件，增强了免疫沉淀实验的稳定性。聚合物磁珠的配体是重组蛋白 A/G（约 14 kDa），同时拥有蛋白 A

和蛋白 G 的 IgG 结合结构域，具有更广的抗体亚型结合范围。试剂盒的洗脱方式多样，既可以用低 pH 的洗脱液将免疫复合物从蛋白 A/G磁珠上洗脱，也可以使用电泳上样缓冲液以变性条件洗脱免疫复合物，直接进行后续检测分析。

本产品可广泛应用于细胞裂解物、细胞分泌上清、血清、腹水等样品中抗原的免疫沉淀反应。

产品组成

保存及运输：2-8℃保存一年有效。

使用方法
1.缓冲液的准备

可使用试剂盒准备的缓冲液，也可根据实际情况配制不同的缓冲液体系。Lysis/Wash Buffer(5×) 在使用前请稀释至并标记为

1×Lysis/Wash Buffer，另根据需求，补加终浓度为0.1%-1% 的 Lysis/Wash Buffer Enhanced，标记为 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)。所有缓冲液在使用前建议用 0.22 μm或者 0.45 μm 滤膜过滤，稀释后的缓冲液建议4℃保存，若试剂浑浊，请立即丢弃。

下列可能用到的试剂及材料未提供，需额外准备：

1) 电泳上样缓冲液，非还原性（5×）：0.3 M Tris-HCl，pH 6.8，5% SDS，50% 甘油，0.5% 溴酚蓝

2) 二硫苏糖醇（DTT）

3) 蛋白酶抑制剂

4) 免疫沉淀所用抗原、抗体

2. 样品准备

方案

I: 贴壁细胞的裂解

1) 小心去除单层细胞的培养基。

2) 用预冷PBS清洗细胞两次。

3) 根据表2的推荐体积向细胞中加入预冷的 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)。冰上孵育 5 min，期间混匀几次。

4) 将上述裂解好的样品转移至一个新的离心管中，约13000×g 离心 10 min，分离细胞碎片。

5) 将上清转移到一个新管中，进行蛋白浓度测定及后续实验，标记为细胞裂解样品。

方案 II：悬浮培养细胞的裂解

1) 将细胞悬液以1000×g离心 5 min，收集细胞，弃上清。

2) 用预冷PBS将细胞团轻轻重悬，将细胞悬液以 1000×g 离心 5 min，收集细胞，弃上清。

3) 向细胞团块中加入预冷1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)。每50 mg细胞团块使用 500 μL。

4) 将上述裂解好的样品在冰上孵育5 min，期间混匀几次。13000×g离心

10 min，去除细胞碎片。

5) 将上清转移到一个新管中，备蛋白浓度测定及后续实验，标记为细胞裂解样品。

2.3 免疫沉淀

抗原、抗体与磁珠的结合顺序可根据实际情况调整，不同的孵育顺序对最终纯度及抗原产量均有影响，以下方案为推荐常用的实验方法。

2.3.1 磁珠漂洗

1) 将 rProtein A/G MagPoly Beads 充分混匀，取 20 µL（0.2 mg）加入 1.5 mL 离心管中。

2) 向磁珠中加入 180 µL 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)，轻微涡旋混匀。

3) 将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸弃上清。

4) 向离心管中加入 1 mL 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)，颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀 1 min，将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸弃上清。

2.3.2 免疫沉淀

方案一

1) 向上述准备好的磁珠（步骤 2.3.1）中加入抗体，抗体推荐用量2-10 µg，用抗体保存液或 1×Lysis/Wash Buffer 补充体积至 500 µL，室温混旋孵育30 min，将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸取上清，留样用于检测。

注：孵育温度和时间范围推荐为：室温、30 min-2 h，或者 4℃、1 h-16 h，根据实际的结合效果进行调整。

2) 向离心管中加入 500 µL 1×Lysis/Wash Buffer，颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀1 min，将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸弃上清，重复至少两次。

3) 向离心管中加入 500 µL 细胞裂解样品（步骤2.2），每个免疫沉淀反应推荐的总蛋白量为500-1000 μg，体积不足 500 uL 可用

1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced) 补足，室温混旋孵育 30 min，将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸取上清，留样用于检测。

注：孵育温度和时间范围推荐为：室温、30 min-2 h，或者4℃、1 h-16 h，根据实际的结合效果进行调整。

方案二

1) 在离心管中，将细胞裂解样品（步骤 2.2）与抗体混合孵育 30 min。推荐抗体用量为2-10 μg，每个免疫沉淀反应推荐的细胞裂解液总蛋白量 为 500-1000 μg，体积不足建议用 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced) 将样品体积调整至 500 μL。

2) 将孵育后的样品加入准备好的磁珠（步骤

2.3.1）中混旋孵育。 注：孵育温度和时间范围推荐为：室温、30 min-2 h，或者4℃、1 h-16 h，根据实际的结合效果进行调整。

3) 将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸取上清，留样用于检测。

2.3.3 磁珠漂洗

1) 向离心管中加入 500 µL 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)，颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀 1 min，将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸弃上清，重复一次。

2) 向离心管中加入 500 µL 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)，连同磁珠转移至一个新 EP 管中，颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀 1 min，将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸弃上清。

2.3.4 洗脱

方案一 低pH 洗脱向离心管中加入 50 µL IP Elution Buffer，室温混旋孵育 10 min，将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸取上清为洗脱液，加入5 -10 μL Neutralization Buffer。

方案二 向离心管中加入 备选洗脱方法（变性洗脱） 50 µL(1×) 电泳上样缓冲液，将样品置于金属浴中，96-100℃加热 10 min。通过磁分离器分离磁珠，保留含有目的抗原的上样缓冲液。

注：两种洗脱方案均包含捕获抗体及目的抗原，低 pH 洗脱样本中抗体为完整结构，变性洗脱样本中抗体解离为重链、轻链，请根据后续实验 需求选择洗脱方案。

注意事项

1) 在进行免疫沉淀操作之前，请务必认真阅读此说明书。

2) 除非另有说明，所有操作建议于 4℃下进行。

3) 在保证洗杂效果的前提下，如果使用 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced) 洗杂，会造成抗体和介质，或者抗原和抗体之间结合效果降低，建议 可以使用 1×Lysis/Wash Buffer 进行洗杂。

4) 磁珠应保存在储存溶液中，防止干燥，使用前请充分混匀。

5) 如果需要在还原条件下洗脱，向 1× 电泳上样缓冲液中加入 DTT ( 终浓度10-20 mM)。

6) 经煮沸后的填料易聚集并且失去抗体结合能力，经煮沸的填料不应再次使用。

7) 为保证最佳的实验结果，请选择特异性较强的抗体进行免疫沉淀反应。

8) 对于免疫沉淀实验，不同类型的抗体与抗原结合的亲和性是有区别的，抗体与抗原结合还会受到的影响，因此，若本试剂盒提供的缓冲体系不能获得很好的实验结果，可自行优化缓冲液进行实验。

9) 实验设计时，建议加入对照组，以备后续实验结果分析。

10) 在确定实验结果前，建议保留各步骤抗原、抗体孵育后的样品以备验证。

11）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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