PKH67绿色荧光细胞链接试剂盒

英文名 PKH67 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling
产品编号 FS1346
产品分类 荧光探针及染色
纯度 储存条件 2-8℃
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产品描述

PKH67细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)(PKH67 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling)是一款基于荧光探针PKH67,用于常规细胞膜标记的检测试剂盒,适用于体外细胞标记,体外细胞增殖以及长期的体内细胞跟踪研究等。

PKH67是一种膜标记探针,与PKH1和PKH2相比,结构上带有更长的脂肪族碳尾,能稳定插入细胞膜脂质区域。正因具更长碳尾,内部数据连续性证明:PKH67具有比PKH2更低的细胞-细胞间转运发生。PKH67呈绿色荧光(见图1),最大激发波长为490nm,最大发射波长是502nm,与标准荧光素(Fluorescein)滤片兼容。PKH67非常适合用于细胞毒性实验,与碘化丙啶(PI,CAT:#FS1202)或7-氨基放线菌素D(7-AAD,CAT:#FS1213)这些细胞活力探针联合使用。根据染料稀释原理,PKH67常用于细胞增殖监测分析,包括抗原特异性的前体频率和带干细胞特性的静息/缓慢分化肿瘤细胞的鉴定。也能用于监测外泌体或脂质体吞噬,细胞-细胞膜转运、吞噬、抗原递呈,以及体内细胞运输研究。

以不分裂细胞为研究对象,通过对体外细胞膜滞留周期和体内荧光强度减弱频率的关联性分析,预测PKH67的体内荧光半衰期为10-12天。这与PKH1和PKH2的体内半衰期相近,这两个探针都成功用于监测周期长达1-2个月的体内淋巴细胞和巨噬细胞运输研究,因此,PKH67适用于需要绿色荧光细胞连接染料的短-中期体内示踪研究,以及体外细胞毒性、吞噬、增殖、抗原递呈,或其它共培养实验。

稀释液C(Diluent C)是本试剂盒配套提供的一种水溶性溶液,特别设计的一种标记媒介能维持细胞活力,同时最大化染料溶解性和标记过程中的染色效率。Diluent C对哺乳动物细胞来说是等渗的,不含去污剂或有机溶剂,也不含生理盐和缓冲剂。根据细胞类型,染料标记后膜的内在化程度,标记细胞可能呈现不同的状态,从明亮,到均匀点状或斑驳状。然而,PKH67荧光在生理范围内不依赖于pH,且每个细胞的荧光强度通常不受染料位置的影响。

图1. PKH67的激发和发射光谱图

FUSHENBIO(复申生物)PKH67细胞连接试剂盒Mini Kit其中100UL规格建议用于小量或初步研究。当使用2ml染色体积(含2μM终浓度的PKH67),本试剂盒含有足量的染料用于检测25次细胞样本(2×107个细胞/次),和足量的Diluent C用于5次细胞样本(2×107个细胞/次);200UL规格适用于中量研究,比如体外细胞增殖或毒性研究。当使用2ml染色体积(含2μM终浓度的PKH67),本试剂盒含有足量的染料用于检测50次细胞样本(2×107个细胞/次),和足量的Diluent C用于30次细胞样本(2×107个细胞/次); 

1ML规格适用于大量或体内研究。当使用2ml染色体积(含2μM终浓度的PKH67),本试剂盒含有足量的染料用于检测125次细胞样本(2×107个细胞/次),和足量的Diluent C用于30次细胞样本(2×107个细胞/次)。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度。

操作步骤

1. 自行准备仪器和试剂(试剂盒不提供,用于常规细胞膜标记)

﹒良好分散,均匀的单细胞悬液(悬浮于组织培养基)

﹒含血清的组织培养基(完全培养基)

﹒不含Ca2+、Mg2+和血清的培养基,或生理盐溶液(比如,DPBS或HBSS)

﹒血清,白蛋白或其他系统兼容的蛋白

﹒聚丙烯锥底离心管(4-15ml)

﹒能控温的离心机(高达1000×g)

﹒荧光分析用仪器(荧光酶标板,荧光或共聚焦显微镜,流式细胞仪)

﹒无菌层流净化罩

﹒血球计数板或自动细胞计数装置

﹒载玻片和盖玻片

2. 常规细胞膜标记

【染色流程】:

以下操作流程使用2ml最终染色体积,含2μM PKH67,以及1×107个细胞/ml。

以下所有步骤都在室温下进行(20-25℃)。

1. 取一锥底聚丙烯离心管制备2×107个细胞的单细胞悬浮液,用无血清培养基清洗细胞一次。

2. 400×g离心细胞5min,得到松散的细胞沉淀。

3. 细胞离心后,轻轻吸掉上清。注意不要移动任何细胞并且残留不超过25μl上清液。

4. 加1ml Diluent C到细胞沉淀中制备成2×细胞悬液,用枪轻轻吹匀以确保完全分散。不可涡旋和不可让细胞长期保留在Diluent C中。

5 染色前立即制备2×染色液(4μM in Diluent C):通过将4μl PKH67乙醇储存液到1ml Diluent C中,充分混匀分散所得。

6. 快速加1ml2×细胞悬液(Step 1.4)到1ml2×染色液(Step 1.5),用枪立即混匀样本。混匀后样本得到的终浓度是1×107个细胞/ml和2μM PKH67。

7. Step 1.6中的细胞/染料悬液孵育1-5min,中间定期混合。染色过程非常快,更长时间无任何益处。

8. 加入等体积(2ml)血清或其他适当蛋白溶液(比如1% BSA)终止染色,孵育1min允许结合多余的探针。

9. 20-25℃,400×g离心细胞10min,轻轻吸掉上清,确保不会移动细胞。用10ml完全培养基重悬细胞,转移到一个干净无菌的锥底聚丙烯离心管中,20-25℃,400×g离心细胞5min。然后用10ml完全培养基清洗细胞沉淀>2次,以确保完全去除未结合染料。

10. 最后一步清洗后,用10ml完全培养基重悬细胞沉淀,用来评估细胞回收,细胞活力和染色强度。离心和重悬沉淀到一理想终浓度的活细胞悬液。

注意事项

1)  PKH67是以溶于乙醇的储存液形式提供,保存的过程中需避光并拧紧盖子,以防止溶液挥发引起的染料浓度提高。使用前需检查是否有结晶,若有结晶,需在37℃水浴溶晶,超声或涡旋直至完全溶解。

2)  Diluent C使用前需置于室温回温之后再配制标记用的细胞和染料工作液。Diluent C是无菌溶液,不含任何防腐剂或抗生素,使用和保存过程中都注意无菌。

3) PKH67不能保存在Diluent C内,保存在Diluent C的染色工作液需在使用前配制,现配现用。

4)  荧光染料均存在淬灭问题,操作和储存过程中需注意避光,以减缓荧光淬灭。

5)  为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

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