Cyanine5.5

产品简介

CY为花菁 (Cyanine) 的缩写，经典的菁染料含有两个含氮杂环，分子内部含有由甲川基 (CH) n 组成的共轭链，n 可为奇数或偶数。这一特性对它们的电子结构可显著的影响电子基态下的平衡结构，共轭链两端或链中间连有杂环、芳环化合物、环烯化合物等与共轭链组成一个大的共轭体系，分子内部的氢可被一定数目的各类取代基取代。CY 系类染料常被用于蛋白，抗体以及小分子化合物的标记，对于蛋白抗体的标记，可以通过简单的混合反应来完成结合。

一般的，Cyanine系列染料包含两种异构体的形式，一种是非磺化花青素（non-sulfonated cyanines），一种是磺化花青素（sulfonatedcyanine）。两者的光谱性质几乎一致，因此大部分应用可相互替换，比如，都可用于标记DNA或蛋白等生物分子。两者的主要区别在于：磺化染料是水溶性的，在水相的标记反应体系内不需要使用有机共溶剂，并且降低染料在水中聚集的可能性，增强标记效率。

Cy 系列属于花菁类染料，其中 Cy SE 是非水溶性形式，Sulfo-Cy SE 是磺酸化的高水溶性形式。被广泛用于标记肽、蛋白质和寡聚体等生物分子。Cy 系列染料除了用于标记生物分子外，也常被用于动物活体成像。由于细胞和组织的自发荧光在近红外波段小，而近红外光在生物组织中的穿透深度较大，因此在检测复杂生物系统时，Cy 系列染料能提供更高的特异性和灵敏度。同时，Cy 系列染料还拥有紫外光区染料和同位素标记无法具备的生物安全性，有利于在活生物体中监控各种标记分子的分布。

Cy dye free acid系列是一类荧光标记染料，含有游离的、未活化的单官能团羧酸，其中Cy free acid是非水溶性形式，Sulfo-Cy free acid是磺酸化的高水溶性形式。在多数情况下，该系列染料不具有反应活性，可用于样品对照或仪器校准。

本品为Sulfo-Cy5.5可用于标记肽、蛋白质和寡核苷酸等生物分子。在生物医学研究中应用广泛，例如可用于小动物体内成像，因为其发射光谱略大于 700nm，处于红光 / 近红外交界区，并且在红外区生物样品包括组织的背景荧光很弱，适用于对背景荧光较忌讳的实验。Ex/Em(nm)=680/710。

产品应用及操作步骤

一、蛋白标记
1. 蛋白准备
1.1)为实现最佳标记效果，需将蛋白（抗体）浓度调整至 2 mg/mL。
1.2)确保蛋白溶液的 pH 在 8.5±0.5 范围内。若 pH 值低于 8.0，可用 1 M 碳酸氢钠调节。
1.3)当蛋白浓度低于 2 mg/mL 时，标记效率将显著降低。为优化标记效果，建议蛋白浓度维持在 2-10 mg/mL 之间。
1.4)蛋白需溶解在不含伯胺（如 Tris 或甘氨酸）和铵离子的缓冲液中，否则会干扰标记反应。

2. 染料准备
使用无水 DMSO 配制Cy5.5 染料，浓度为 10 mM 的储备液。通过玻璃棒或涡旋混匀。
注意：Cy5.5 染料储备液建议分装后避光保存于 -20 ℃ 或 -80 ℃。在后续标记实验前，需用 500 μg/mL 的缩合液（EDC hydrochloride FS0602）进行活化。

3. 染料工作液用量计算
Cy5.5 染料的使用量根据标记蛋白的量决定。Cy5.5 染料与蛋白的最佳摩尔比约为 10。
示例：需标记 500 μL、2 mg/mL 的 IgG（MW = 150,000）。假设用 100 μL DMSO 溶解 1 mg CY 染料，则计算如下：
1) IgG (mmol) = IgG (mg/mL) ×IgG (mL) / IgG (MW) =2 mg/mL×0.5 mL / 150000 mg/mmol= 6.7×10^6 mmol
2) Cy5.5 (mmol) = IgG (mmol) ×10 =6.7×10^6 mmol×10 = 6.7×10^5 mmol
3) Cy5.5 (μL) = Cy5.5 (mmol)×Cy5.5 (MW)/mg/Cy5.5 (μL) = 6.7×10^5 mmol× 917.06 g/mol / 0.01 mg/μL
二、标记反应
1) 按计算量取用新鲜配制的 10 mM的 Cy5.5 染料母液（约 10 μL）并加入 50 μL 500 μg/mL 缩合液进行活化。将此混合液缓慢加入 0.5 mL 蛋白样品溶液中，轻轻混匀并短暂离心，使样品沉至反应管底部。避免剧烈摇晃，以免蛋白变性或失活。
2) 将反应管置于避光环境下，在室温条件下轻轻摇晃孵育 60 分钟。每隔 10-15 分钟，轻轻翻转反应管数次，以确保充分混合，提高标记效率。

活体成像步骤

参考方法：将 Cy5.5-FFRck-fVIIa 和 Cy5.5 染料单独静脉注射 (i.v.) 到右侧带有表达 TF 的 ASPC-1 和不表达 TF 的 MiaPaCa 胰腺肿瘤异种移植瘤的无胸腺裸鼠 (nu/nu) 中，并测试结合的持续时间和稳定性，以便能够跟踪治疗反应。

结果：从第 1 天到第 26 天，在 ASPC-1和 MiaPaCa肿瘤中均观察到胰腺肿瘤异种移植中的 VEC 中 Cy5.5-FFRck-fVIIa 与 TF 的特定定位，而单独未结合的 Cy5.5 没有观察到特定定位。