Annexin V-APC / 7-AAD细胞凋亡检测试剂盒

产品简介

磷脂酰丝氨酸（PS）是一种带负电荷的磷脂，正常细胞中，PS只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的PS由脂膜内侧翻向细胞膜外侧，使PS暴露在细胞膜外表面。而Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被公认为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

本产品将Annexin V进行荧光素（APC）标记，以标记了的Annexin V作为探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。由于凋亡晚期或坏死细胞膜丧失完整性，而7-氨基放线菌素D（7-Amino Actinomycin D, 7-AAD）可与双链 DNA 特异性结合并产生强烈的荧光，与Annexin V搭配使用，可区分处于不同凋亡时期的细胞。

产品组成

保存及运输：2-8℃避光保存，至少1年有效。试剂A:Annexin V-APC禁止冷冻保存，运输：冰袋运输

试剂配制

1×Annexin V Binding Buffer：取 1 mL Annexin V Binding Buffer (10×)加入 9 mL 去离子水中混匀。（去离子水需自备）

使用方法

一步法

1．细胞按照实验方案进行凋亡诱导，300 ×g 离心 5 min，弃上清，收集细胞，PBS 洗涤一次，轻轻重悬细胞并计数。

2．取 1~5 × 10⁵ 重悬的细胞，300 ×g 离心5 min，弃上清。用 PBS洗涤细胞一次，离心后弃上清，加入500 μL稀释的1 × Annexin V Binding Buffer 重悬细胞。

3．细胞悬液中加入5 μL的Annexin V-APC Reagent 和 5 μL 的 7-AAD Reagent (100μg/mL)。

4．轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育15~20 min。

5．立即上机检测。如不能及时检测，请于冰上避光静置并于 1 小时内完成检测。

【注】流式细胞仪检测时 Annexin V-APC 可用 APC 通道，7-AAD 选择 PerCP/Cy5.5 通道。

两步法

1．细胞按照实验方案进行凋亡诱导，300 ×g 离心 5 min，弃上清，收集细胞，PBS 洗涤一次，轻轻重悬细胞并计数。

2．取1~5 × 10⁵ 重悬的细胞，300 ×g离心5 min，弃上清。用 PBS 洗涤细胞一次，离心后弃上清，加入100 μL稀释的1 × Annexin V Binding Buffer重悬细胞。

3．细胞悬液中加入 2.5 μL 的 Annexin V-APC Reagent 和 2.5 μL 的 7-AAD Reagent (100μg/mL)。（由于两步法分辨率更高，染色液用量减半依然可得到媲美一步法的效果；用户亦可根据自己的模型进行滴定后加入适量的染色液，用更少的量获得高质量的结果。）

4．轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育15~20 min。

5．加入 400 μL 稀释的 1 × Annexin V Binding Buffer，混匀样本。

6．立即上机检测。如不能及时检测，请于冰上避光静置并于1小时内完成检测。

【注】流式细胞仪检测时 Annexin V-APC 可用 APC 通道，7-AAD 选择 PerCP/Cy5.5 通道。

结果示例

注意事项

1）检测贴壁细胞时，需收集诱导凋亡后产生的悬浮细胞，并与后续收集的贴壁细胞一起检测。

2）本试剂盒推荐使用悬浮培养细胞。如果是贴壁细胞，需用不含EDTA的胰酶消化，如消化不当，可能引起假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含2%BSA的PBS中，防止进一步的损伤。

3）如果使用含 EDTA 的胰酶，收集细胞后应充分清洗，确保 EDTA 被去除干净。

4）染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。

5）荧光物质均易发生淬灭，在进行荧光观察时，尽量缩短观察时间，同时在操作和存放过程中也尽量注意避光保存。

6）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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