抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性染色试剂盒

产品简介

酸性磷酸酶(Acid Phosphatase)，也称酸性磷酸酯酶，在酸性条件下可以催化磷酸酯键的水解。酸性磷酸酶是一个蛋白家族，哺乳动物中其分子量从18kD到100kD不等。酸性磷酸酶主要分为两类，一类为抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase, TRAP)，一类为抗氟离子酸性磷酸酶。

抗酒石酸酸性磷酸酶是一种糖基化的含金属蛋白酶，在破骨细胞(osteoclast)和破软骨细胞(chondroclast)中高表达。在活化的巨噬细胞和神经元中也有表达。抗酒石酸酸性磷酸酶在细胞信号转导、细胞增殖和分化等方面起重要作用，也和活性氧产生和铁离子转运等有关。抗酒石酸酸性磷酸酶可以被破骨细胞释放到血液中，几乎被认为是是机体破骨活性的唯一血液指标。

Para-nitrophenyl phosphate (pNPP)是一种常用的磷酸酶显色底物，在酸性条件下，可在酸性磷酸酶作用下生成para-nitrophenol。para-nitrophenol (p-nitrophenol)在碱性条件下，呈黄色产物，可以在400-415nm检测吸光度。产物黄色越深， 说明酸性磷酸酶检活性越高，反之则酶活性越低。据此通过比色分析就可以计算出酸性磷酸酶活性水平。在适量的酒石酸存在的情况下进行酸性磷酸酶的活性检测，检测得到的酸性磷酸酶活性就是抗酒石酸酸性磷酸酶活性。

本试剂盒抗酒石酸酸性磷酸酶检测试剂盒(Tartrate Resistant Acid Phosphatase Assay Kit)是一种用于快速、便捷地检测细胞或组织样品的裂解或匀浆产物的上清液、血浆、血清、尿液等样品中内源性的抗酒石酸酸性磷酸酯酶活性的试剂盒。包括标准品和空白对照，本试剂盒共可进行100-120个样品的检测。

产品组成

存储条件：-20℃保存，一年有效。 

操作步骤：
1. 试剂准备：

1-1将试剂盒所有试剂取出，恢复至室温使用。
1-2. 显色底物溶液配置：取一管试剂B显色底物ACP Assay Buffer，溶解于2.5ml的检测缓冲液中，充分溶解和混匀，冰上放置。新鲜配制的显色底物溶液需在6小时内使用。
1-3. 标准品工作液配置：取10μl p-nitrophenol溶液(10mM)，用检测缓冲液稀释至0.2ml，最终浓度为0.5mM。

按下表继续稀释：

2. 样品准备：
2-1. 细胞或组织裂解液的准备：采用适当细胞或组织裂解液裂解细胞或组织，建议使用 Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)（推荐货号CAT:FS1008）裂解相关样品。如果有必要需进行适当匀浆，随后离心取上清，用于抗酒石酸酸性磷酸酶的检测。注意：裂解液中不能含有磷酸酶抑制剂。一般细胞数量在10⁶以上，组织应在100mg以上，3000~4000g 离心取上清样品可以-80℃冻存，但需避免反复冻融。
2-2. 血浆、血清和尿液的准备：血浆和血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，但为了消除样品本身颜色的干扰，需设置加了血浆或血清但不加底物的对照。尿液通常也可以直接用于测定。上述样品可以-80℃冻存，但需避免反复冻融。
2-3. 样品的稀释：如果样品中含有较高活性的抗酒石酸酸性磷酸酯酶，可以使用原有的裂解液或PBS等进行稀释，也可以采用试剂。
盒中的检测缓冲液进行稀释。如果使用试剂盒中提供的检测缓冲液进行稀释，需注意保留足够的检测缓冲液用于试剂盒的检测过程。

2-4.植物样品： 取适量的植物组织加入少量 PBS 或生理盐水， 充分捣碎或研磨，静置 30min，用纱布或滤纸过滤，4000g 离心 20min，留取上清液并测量体积，-20℃冻存， 用于 TRAP 的检测。

2-5.高活性样品：如果样品中含有较高活性的 TRAP，可以使用 ACP Assay Buffer、PBS 或生理盐水稀释后再行检测。
3. 参考下表TRAP加样：按按照下表设置空白孔、标准孔、空白孔，溶液应按照顺序依次加入，并 注意避免产生气泡；如果样品中的 TRAP 活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再 进行测定，样品的检测最好能设置平行孔。

4. 用枪头轻轻吹打混匀，也可借助摇床进行混匀。
5. 37℃孵育5-10分钟。(说明：待测样品中酒石酸酸性磷酸酶活性较低时，可适当延长孵育时间至30分钟)
6. 每孔加入160μl反应终止液终止反应。此时，标准品或有酒石酸酸性磷酸酶活性的孔会呈现不同深浅的黄色。
7. 在405nm测定吸光度。如果不能测定405nm，也可以在400-415nm范围内检测吸光度。如果不能立即测定，可以在数小时内完成测定，所显现的黄色在数小时内稳定。
8. 酸性磷酸酶活性单位的定义：在pH4.8，37℃条件下，每分钟水解para-nitrophenyl phosphate显色底物产生1微摩尔p-nitrophenol所需的酸性磷酸酶的量定义为一个酶活力单位。
9. 根据酶活性定义，计算出样品中的抗酒石酸酸性磷酸酯酶活性。

计算： 系列标准品(1~6 号)浓度(即 p-NP 含量)0.002、0.004、0.008、0.012、0.016、0.02 μM 为横坐标，以对应的标准孔吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，根据测定孔的吸光度在标 准曲线上查得待测样品 p-NP 的生成量。

酸性磷酸酶活性单位的定义：在 pH 值 4.8 37℃条件下，每分钟水解 pNPP 显色底物 产生1 μM p-NP 所需的酸性磷酸酶的量定义为一个酶活力单位，根据酶活性定义，计算出 样品中的抗酒石酸酸性磷酸酶活性。

TRAP 酶活性(μM/min)=待测样品 p-NP 生成量/孵育时间

注意事项：

1. 如果希望进行酶活性的绝对定量，进行酶反应时必须注意精确计时。此时推荐采用孵育30分钟等较长的时间，以减小操作过程中的时间误差。同时如果样品中酶活性较高，则可以预先适当稀释样品。

2. p-nitrophenol溶液对人体有害，反应终止液有腐蚀性，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。

3. 样品溶液中须避免出现各种酸性磷酸酶抑制剂。

4. 一管显色底物配制后需当日使用完毕，因此请注意适当多准备一些样品一起检测，以避免试剂盒浪费。

5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。