ENG-2 AM 钠离子指示探针

产品描述

Enhanced NaTrium Green-2 AM (ENG-2 AM)是Asante NaTrium Green-2 AM（ANG-2 AM）的替代物，是一种具细胞膜渗透性的新型钠离子（Na+）荧光探针。一旦进入细胞后，经非特异性酯酶水解生成水溶性形式的探针。不同于传统Na+探针SBFI，ENG-2是一种可见光光谱范围的探针，激发波长范围是488-525nm，发射波长是545nm。ENG-2 AM具有容易加载、缓慢泄露、良好光稳定性和宽动力学范围等理想特征，也正好弥补传统Na+荧光探针SBFI AM（#FS1226）的缺陷。

产品特性

1） 同义名：ENG-2 AM

2） 分子式：C53H60Cl2N2O18

3） 分子量：1084 g/mol

4） 纯度：≥90%（HPLC）

5） 最大激发波长：525 ± 3 nm（Methanol）

6） 最大发射波长：545 ± 3 nm（Methanol）

7） 解离常数（Kd）：20mM（in the absence of K+）

8） 动力学范围（Fmax/Fmin）：29

9） 溶解性：DMSO

使用方法（以下步骤仅做参考，具体请根据实际情况或参考文献资料来调整。）

1.1使用无水DMSO溶解ENG-2 AM（Mw：1084 g/mol）配制成1-5mM储存液，比如往50μg ENG-2 AM冻干粉内加入23μl DMSO，充分溶解后配制成2mM储存液。-20ºC分装干燥冻存，避免反复冻融。

1.2 通常在含适当浓度AM探针的无血清培养基中实现探针加载。建议正式实验前向加载培养基内加入Pluronic F-127（#CAT:FS0432）以促进AM探针的分散。可用DMSO配置20% Pluronic F-127储存液或其他浓度，只需在正式实验前将其与ENG-2 AM储存液混合，然后加入加载培养基，保证其终浓度＜0.1%（w/v）。

1.3 室温或37℃孵育细胞（可能在室温的探针加载质量会高些），孵育浓度通常为1-10µM，孵育时间通常为30-60min，具体的请根据实际情况或参考文献资料。

1.4 【可选】对于大分子量AM探针（分子量≥1000g/mol），孵育结束，加入不含AM探针的细胞加载培养基额外孵育20-60min，以确保细胞将AM基团完全去酯化。

1.5 用不含血清和探针的培养基清洗细胞至少一次，以降低细胞外背景荧光。

1.6 最后用合适的仪器来检测荧光信号。最大激发波长525nm，最大发射波长545nm。

【操作注意事项】：

2.1 如果细胞加载培养基是以碳酸氢钠为缓冲体系，那么加载需要含5% CO2的环境内进行，以防止因CO2损失引起的培养基碱化。

2.2 如果细胞加载培养基含血清，那需适当提高AM探针工作浓度，以补偿因AM探针与血清蛋白结合引起的损失。

2.3 某些情况下，对分子量接近或超过1000的AM探针，需用不含AM探针的细胞加载缓冲液进一步孵育20-60min，以保证细胞内酯酶能充分降解AM基团。

2.4 探针的加载时间和浓度因具体的细胞类型而有差异，请根据具体的细胞类型来优化。

2.5 对每一种探针有必要通过校准（calibration）来得到实际解离常数（Kd）。物理条件如温度，pH，离子强度或溶液粘度，以及探针与细胞组成成分如蛋白质的相互作用，都会影响Kd值。实际情况细胞内的Kd比体外溶液通常要高。因此，细胞水平研究有必要进行校准确认实际Kd值。

2.6 对于ENG-2，虽然最大激发波长在525nm，但其极强的荧光亮度使其能够用标准的488nm滤片来激发，与Fluo系列的可见光钙离子指示探针检测手段一致。值得注意的是，488nm激发下得到的荧光强度约为最大激发波长下的40%。

流式检测参考方法：

试剂准备

储备液配制：将EPG-2 AM用无水DMSO配制成合适浓度的储备液，由于AM酯形式的探针水溶性较差，溶解时可使用必要的Pluronic F-127，比如在加载探针到细胞之前，将探针的DMSO溶液与等体积25%（w/v）的Pluronic F-127混合。

工作液配制：根据实验需求，用合适的缓冲液将储备液稀释成工作液，如用不含钾离子的PBS缓冲液。

细胞准备

1）细胞培养：将待检测的细胞培养至对数生长期，确保细胞状态良好。

2）细胞收集：用胰酶消化细胞或其他合适的方法收集细胞，然后用PBS等缓冲液洗涤细胞2-3次，去除培养基中的血清等成分，以500-1000g离心5-10分钟收集细胞沉淀。

3）细胞重悬：用无钾离子的缓冲液将细胞重悬，调整细胞浓度至合适范围，如1×10 6至1×10 7个/mL。

探针加载

1）加载探针：将适量的EPG-2 AM工作液加入到细胞悬液中，使探针终浓度达到5μM-10μM，轻轻混匀。

2）孵育细胞：将细胞与探针的混合液在合适的温度下孵育，一般在37℃孵育40分钟-4小时，期间可适当轻柔振荡或翻转细胞悬液，以确保探针充分进入细胞。

3）洗涤细胞：孵育结束后，用无钾离子的缓冲液洗涤细胞2-3次，去除未进入细胞的探针，离心条件与收集细胞时相同。

流式检测

1）仪器校准：开启流式细胞仪，用标准微球等对仪器进行校准，确保仪器的光路、流速等参数处于正常状态。

2）设置参数：根据EPG-2 AM的荧光特性，设置激发波长为488nm或517nm，发射波长为546nm左右。

3）检测样本：将加载好探针的细胞悬液加入到流式细胞仪的样品管中，进行检测，记录细胞的荧光信号。

4）数据分析：使用流式细胞仪配套的数据分析软件，对检测到的数据进行分析，如绘制荧光强度直方图、散点图等，计算细胞内钾离子的相对浓度或浓度变化等。

注意事项

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2）ENG-2 AM易受潮，粉末需干燥保存；

3）ENG-2 AM储存液可用DMSO溶解，不推荐长期保存，甚至是-20ºC。建议条件允许，最好现配现用。

4）微量包装的产品定量精准，粉剂再进行分装会因为静电/产品性状等原因造成较大损失，再分装或重新称量前请斟酌！建议请直接在原包装瓶/管内按照所需加入适量的溶液配成浓储分装。