细菌死活染色试剂盒(DMAO/PI)

产品简介

DMAO，即N, N-dimethylaniline N-oxide，是一种核酸绿色荧光染料，对于革兰氏阳性和阴性细菌均适用，且既能染色活细菌，也能染色死细菌。该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，优先结合双链DNA。DMAO非常稳定，在室温下进行常规操作和保存不易降解。PI是一种非渗透性荧光染料，不能穿过具有生物活性的细胞质膜，因此对于具有完整细胞膜的细菌不能染色。而对于坏死细菌，其细胞膜的完整性丧失，PI可进入细胞核并与双链DNA结合，并嵌入细菌的DNA双螺旋形成PI-DNA复合物从而产生红色荧光，这种结合很少或几乎没有序列偏好，每4-5个碱基对插入一分子PI染料。将DMAO与PI联合使用检测细菌的死活，具有完整细胞膜的活细菌呈现绿色荧光，细胞膜受损的死细菌同时呈现绿色与红色荧光。

DMAO-DNA复合物的最大激发光波长为503nm，最大发射光波长为530nm；PI-DNA复合物的最大激发光波长为535nm，最大发射光波长为617nm。DMAO-DNA和PI-DNA的激发光谱和发射光谱参考图1，可分别使用FITC和Cy3通道观察。

本品中文名称细菌死活染色试剂盒(DMAO/PI)，英文名称LIVE/DEAD Bacterial Staining Kit with DMAO & PI，或LIVE/DEAD Bacterial Viability Kit with DMAO and PI，也称细菌活力检测试剂盒(Bacterial Viability Assay Kit)或细菌毒性检测试剂盒(Bacterial Cytotoxicity Assay Kit)，是一种高效、便捷、灵敏的基于DNA绿色荧光染料DMAO和红色荧光染料碘化丙啶(Propidium iodide, PI)的双荧光染色法检测细菌死活的试剂盒。本试剂盒检测时，活细菌呈现绿色荧光，死细菌呈现绿色和红色两种荧光。本试剂盒可使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光酶标仪、流式细胞仪等荧光检测系统进行检测。

本试剂盒提供的DMAO与PI均为1000×的储存液，溶液经过优化，对大多数细菌都适用，但为了获得更满意的结果，对于不同类型的细菌请自行进行一定的浓度摸索，DMAO和PI的使用终浓度一般为0.5-2×，最优先的推荐终浓度为1×。同时，本试剂盒提供检测缓冲液，该缓冲液可用于细菌死活染色工作液的配制。

图1.DMAO-DNA和PI-DNA的激发光谱和发射光谱。

使用方法(以下步骤仅用作示例以指导科研人员开展自身细菌样本的染色。)

一、培养条件和细菌悬液的制备

【注意】：用本试剂盒进行细菌染色，务必要小心去除培养基残留，因为，核酸和其它培养基成分可能以不可预料的方式与DMAO和PI结合，导致染色结果发生不可接受的变动。简单的一次清洗步骤通常足以去除培养基内含的培养基成分干扰物残留。不建议使用磷酸盐清洗缓冲液，无叠氮钠无钙镁（[注]叠氮会损伤活菌 + 淬灭荧光，磷酸盐清洗缓冲液，因此可能降低染色效率。）也可用无菌生理盐水代替。

1.1 用营养肉汤培养大肠杆菌或金黄色葡萄球菌（30ml）使其生长至对数生长后期。

1.2 于10000×g离心10-15min，浓缩25ml细菌培养物。

1.3 吸走上清液，用2ml 0.85% NaCl或适当缓冲液来重悬沉淀。

1.4 取1ml重悬菌液分别加入含20ml 0.85% NaCl或适当缓冲液的30-40ml离心管（设置为活细菌组），用含20ml 70%异丙醇（也可以用其他方法比如高热处理杀死细菌）的30-40ml离心管（设置为死细菌组）。

1.5 两管样品（分别为活细菌组和死细菌组）于室温孵育1h，每隔15min颠倒混匀一次。

1.6 两管样品（分别为活细菌组和死细菌组）于10000×g离心10-15min。

1.7 用20ml 0.85% NaCl或适当缓冲液重悬沉淀，并且按照步骤1.6再离心一次。

1.8 分别用10ml 0.85% NaCl或适当缓冲液重悬两管样品。

1.9 分别取3ml菌液测定670nm的光密度（OD670），用玻璃或丙烯酸酯比色皿（1cm路径）。

1.10 对于大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的建议染色浓度，根据你的仪器类型（荧光显微镜、荧光光度经、荧光酶标仪）或流式细胞仪来参考相应部分的染色条件。

二、染色工作液配制

常用方法：用试剂盒中的组分C（ FS4006-C检测缓冲液）把试剂盒中的存储母液稀释成（100×）

三、荧光显微镜操作步骤

3.1细菌准备：取适量菌液（在合适的液体培养基中培养细菌至对数生长期。），10,000×g室温离心5 min，弃上清，用生理盐水(#FSH077)洗涤1次，然后用生理盐水将菌液浓度调整至约10⁸个细菌/ml (OD670≈0.3)。

3.2 染色：按照每100μl菌液，加1µl染色工作液(100×)的比例混匀。37℃避光孵育10~15 min 。不同的细菌菌种最佳孵育时间可能有所不同，以5 min作为初始孵育时间，后续可以根据实际染色效果对染色时间进行适当调整和优化，以得到更加理想的染色效果。

注1:轻柔吹打混匀（不要剧烈涡旋，避免活菌膜破损）

注2:不要冰浴低温：会降低 DMAO 跨膜进入活菌效率，绿色显著减弱。

3.3 检测：孵育结束后，取10µl的菌液滴加在载玻片上，并盖上24mm方形盖玻片，在荧光显微镜下观察染色效果。

注：由于细菌比较小，观察会有一定的难度，且荧光容易淬灭，须进行预实验，尽量调整好参数后再观察。

活菌和死菌的荧光可能用标准的荧光素长通滤片设置来同时观察。DMAO为绿色荧光，Ex/Em=503/530nm；PI为红色荧光，Ex/Em=535/617nm。替代方案的话，活菌（绿色荧光）和死菌（红色荧光）可分别用双通道：荧光素FITC和Texas Red带通滤光片设置。用于本试剂盒检测的建议荧光显微镜滤片设置见表1。

表1 适用于本试剂盒检测用的常见滤光片特征

油镜100×计数＞5个视野，计算存活率：存活率（%）=绿色荧光细胞数/(绿色+红色光细胞数)×100

四、流式细胞仪操作步骤

4.1细菌准备：取适量菌液（在合适的液体培养基中培养细菌至对数生长期。），10,000×g室温离心5 min，弃上清，用生理盐水(#FSH077)洗涤1次，然后用生理盐水将菌液浓度调整至约10⁸个细菌/ml (OD670≈0.3)。再用生理盐水以1:100稀释，使最终菌液浓度为10⁶个细菌/ml。

注：细菌培养基中含有的碎片可能会影响流式结果，建议细菌培养基0.2µm过滤处理。

4.2染色：取1ml菌液，加10µl的细菌死活染色工作液(100×)比例混匀。同时取1ml菌液，加入10μl检测缓冲液，用作流式细胞仪检测时的阴性对照。另外，需要准备两管1ml细菌菌液，分别加入10μl DMAO单染工作液(100×)或10μl PI单染工作液(100×)，用于流式单染的补偿调节。37℃避光孵育10~15 min。不同的菌种最佳孵育时间可能有所不同，以15min作为初始孵育时间，后继可以根据实际检测效果对孵育时间进行适当优化以得到最佳的效果。

4.3检测：孵育完成后，可以直接进行流式细胞仪检测，也可以10,000×g室温离心5分钟沉淀细菌，吸净液体后每个样品加入0.5ml生理盐水重悬细胞后用流式细胞仪检测。注意整个过程均需注意避光操作。染色后，将样品置于冰上，并尽量在1小时内进行流式细胞仪检测和分析。

注1：使用仅含缓冲液、并且未经染色的细菌菌液用于流式细胞仪的阴性对照设置。

注2：细菌圈门(Gate)时，注意不要圈入细菌碎片，并使用DMAO或PI单染的细菌进行调节补偿。双染细菌流式检测应获得两个相对独立的细菌群：只有绿色荧光的活细菌群及绿色与红色荧光双染的死细菌群。

注3：由于流式检测比较灵敏，使用的荧光探针浓度可能要比荧光显微镜检测时要低，此时可根据细胞类型和实际染色情况对DMAO或PI的稀释倍数进行适当调整。

注4：由于细菌比较小，建议使用专门的能检测细菌的流式细胞仪。

注5：流式细胞仪参数的设置对于细菌的检测很关键。建议通过绿色荧光或者红色荧光对侧向散射结果图(SSC)，圈出细菌群，然后通过绿色荧光对红色荧光流式结果图展示细菌群的分布。菌死活的浓度计算可以通过绿色或者红色荧光对侧向散射流式结果图、或者绿色荧光对红色荧光流式结果图，根据实际情况选择活死菌分群最明显的结果图来进行计算。

注6：死活菌群的分布位置可能会因细菌种类、仪器参数设置而存在一些差别，某些点会分布于划定区域以外，须进行适当的评估和参数的调整。

仪器的检测配置可能要因实际情况来调整，但此处列出的检测技术和设置参数适用于市场上绝大多数流式细胞仪。

FL1通道： (530/30nm) DMAO (检测活菌) 

FL3通道： (＞670nm) PI (检测死菌) 

阈值设定：排除粒径＜0.2um碎片（避免假阳性）

对数期细菌，用 0.85% NaCl 洗涤2次，去掉培养基（注：培养基里的蛋白、血清会非特异性结合染料，导致有效染料浓度下降）。

调整浓度到10⁶–10⁷ CFU/mL（OD600≈0.05–0.1）。（菌液浓度过高（>10⁸ CFU/mL），染料被大量细菌 “抢光”，单个细菌上结合的染料太少，流式检测不到。）

五、荧光酶标仪检测

5.1细菌准备：取适量菌液（在合适的液体培养基中培养细菌至对数生长期。），10,000×g室温离心5 min，弃上清，用生理盐水(#FSH077)洗涤1次，然后用生理盐水将菌液浓度调整至约10⁸个细菌/ml (OD670≈0.3)。再用生理盐水以1:100稀释，使最终菌液浓度为10⁶个细菌/ml。

5.2染色：按照100μl菌液/孔加入96孔板中，每孔加1µl的细菌死活染色工作液(100×)，混匀。37ºC避光孵育10~15 min。不同的菌种最佳孵育时间可能有所不同。以15 min作为初始孵育时间，后继可以根据实际检测效果对孵育时间进行适当优化以得到最佳的效果。

5.3检测：孵育结束后，用荧光酶标仪检测RFU (Relative fluorescence values)。DMAO为绿色荧光，Ex/Em=503/530nm；PI为红色荧光，Ex/Em=535/617nm。

结果判断与数据验证分析

注意事项

1) 由于试剂盒内DMAO和PI的组分量少，室温回温充分融化后，务必低速离心沉至管底后再开盖。

2) 两款探针溶液本身就是溶于DMSO中，所以后续无需再单独添加，第一次使用可将DMAO和PI根据单次用量分装保存，密封后置于≤-20℃避光保存。

3) 组分C检测缓冲液经过过滤除菌处理，在使用时须注意避免微生物污染，否则很可能严重影响染色效果。如果检测缓冲液发生浑浊等明显的微生物污染，就不能继续使用。

4) DMAO 和PI结合核酸，PI是潜在的诱变剂，目前没有数据阐明DMAO的诱变性或毒性，两种试剂使用都需做恰当防护。DMSO能促进有机分子进入组织。强烈建议处理DMSO储存液时戴双层手套。对于核酸染料，含此类染料的试剂经活性炭吸附后再进行废液处理。活性炭之后经焚烧来破坏染料。

5) 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

常见问题及解决方案

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