PBFI AM ( K+ Indicator)钾离子指示探针

产品简介

PBFI，英文全名 Potassium-binding Benzofuran Isophthalate，一种 K+敏感的荧光探针，用来测定细胞和细胞内区隔（Intracellular compartments）的 K+水平变化。虽然 PBFI 对K+的选择能力弱于 Ca2+指示剂比如 Fura-2，但在其他一价阳离子存在体系中，PBFI 足以检测 K+的生理浓度。结合离子后的 PBFI 光谱变化可通过激发光比率测定来分析，其能与使用相同光滤片和仪器检测的探针 Fura-2 共同使用。

PBFI 对 K+的解离常数（Kd）非常依赖于 Na+的存在与否。在不含 Na+的体系，PBFI 对 K+的 Kd 值为 5.1mM；而在含 135mM K+/ Na+总浓度（约为生理离子强度）的溶液体系，PBFI 对 K+的 Kd 值为 44mM；若缓冲液中的 Na+用四甲基氯化铵所替代，PBFI 对 K+的 Kd 值变为 11mM。氯化胆碱和 N-甲基葡萄糖胺是培养基中另两种可能替代 Na+的化合物。虽然 PBFI 对 K+的选择性比 Na+仅强 1.5 倍，这一选择能力已足以满足检测需求，因为正常情况细胞内 K+浓度比 Na+高 10 倍左右。

本品为乙酰氧基甲基酯（Acetoxymethyl ester, AM ester）形式的 PBFI，CAS NO：124549-23-1，具有细胞膜渗透性，只需简单孵育即可进入细胞，常用加载浓度范围 5-10µM，加载时间 40min-4h，根据具体的实验要求和细胞类型来调整。

基本特性

CAS：124549-23-1

同义名：Potassium-binding Benzofuran Isophthalate Acetoxymethyl ester

化学名：4,4'-[1,4,10,13-tetraoxa-7,16-diazacyclooctadecane-7,16-diylbis(5-methoxy-6,2-benzofurandiyl)]bis-

1,3-benzenedicarboxylic acid, tetrakis[(acetyloxy)methyl] ester

分子式：C58H62N2O24

分子量：1171.1

纯度：≥95% (HPLC)

Ex/Em：~340,380/500 nm

外观：黄色至橙色粉末

溶解性：溶于 DMSO（10mM）和甲醇

储存条件：-20℃干燥避光保存，2年有效。小量分装避免反复冻融，至少3个月稳定

使用方法（以下步骤仅做参考，具体请根据实际情况或参考文献资料来调整。）

1）配置1-10mM PBFI AM储存液：比如，实验前取一管50μg PBFI AM 置于室温回温至少20min，低速离心后，往管内加入8.5397ul 无水DMSO 使其充分溶解后，制备成5mM 储存液。若单次用不完，需分装冻存。

2）准备25%（w/v）Pluronic F-127：100mg Pluronic F-127 粉末中加入400μl DMSO，配制成25%(w/ v) DMSO 母液。溶解过程需要在40-50℃加热20-30min。溶液室温保存，不用冷藏。如有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。【也可配置成其他浓度Pluronic F-127，只需保证最终工作体系内Pluronic F-127< 0.1% (w/v)】。

3）于正式实验前，将PBFI AM 储存液于等体积25%（w/v）Pluronic F-127 混匀。【注意：PBFI AM 水溶性差，必须借助Pluronic F-127 来促进其分散进入水溶性加载缓冲液。两者只能在实验前混匀，不能保存待用】。

4）将上述混合液加入适量细胞加载缓冲液（如生理缓冲液PBS，无血清细胞培养基等）达到所需的工作浓度，加入细胞内进行探针标记。孵育温度可以是室温或37ºC，孵育浓度通常为5-10μM，时间40min-4h，具体的孵育浓度和时间请参考相关的文献资料。

5）孵育结束，再加入不含探针的细胞加载缓冲液额外孵育20-60min，以保证细胞将PBFIAM 完全酯酶化。

6）最后用生理缓冲液或无血清培养基清洗细胞至少一次，以降低胞外背景荧光。

7）用合适的仪器检测荧光信号，分别收集激发波长340nm，380nm，发射波长500nm（发射波长范围450-550nm，根据你的实际荧光信号看看最大波长吸收峰大概在哪个位置）。根据双激发波长收集荧光信号的比值来确定离子浓度。

注意事项

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2）如果细胞加载缓冲液是以碳酸氢钠为缓冲体系，那么加载需要含5% CO2 的环境内进行，以防止因CO2 损失引起的缓冲液碱化。

3）如果细胞加载缓冲液含血清，那需适当提高AM 探针工作浓度，以补偿因AM 探针与血清蛋白结合引起的损失。

4）PBFI AM由于水溶性较差，建议使用Pluronic F-127以优化探针的细胞加载效率。通常情况，将PBFI AM的DMSO储存液与等体积Pluronic F-127（25% w/v）混合均匀，之后即刻加入适量的细胞加载缓冲液（cell loading buffer）中达到所需浓度。

5）某些情况下，对分子量接近或超过1000 的AM 探针，需用不含AM 探针的细胞加载缓冲液进一步孵育20-60min，以保证细胞内酯酶能充分降解AM 基团。

6）探针的加载时间和浓度因具体的细胞类型而有差异，请使用前参考相应的文献资料来设计和摸索最佳条件。

7）探针的细胞Kd 值与溶液Kd 值有差异，PBFI 的胞内Kd 值可用K+载体如缬氨霉素（valinomycin）来校正（calibration）。具体可参考文献来操。

8）微量包装的产品定量精准，粉剂再进行分装会因为静电/产品性状等原因造成较大损失，再分装或重新称量前请斟酌！建议请直接在原包装瓶/管内按照所需加入适量的溶液配成浓储分装。

参考文献：a) Clementi EA et al. Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes. J Vis Exp. 2014 Feb17;(84):e51008. doi: 10.3791/51008. b) Harootunian et al. Fluorescent ratio imaging of cytosolic free Na+ infibroblasts and lymphocytes. Journal of Biological Chemistry 1989..