MitoTracker Red CM-H2Xros红色线粒体荧光探针

Ex (nm)/Em(nm):579/599 nm

保存及运输：-20℃避光干燥保存，至少1年有效。运输：冰袋运输。

使用方法

1. 储存液的配制

本品是以粉末形式提供，使用前需将本品回温至室温。之后使用细胞培养级别的无水DMSO（CAT:FS0306）将其充分溶解至终浓度1 mM。 本品M. Wt.= 497.08 g/mol，换算下来，50 µg粉末只需加入100.6 µL DMSO即可得到1 mM储存液。根据单次的使用量将储存液分装后放到-20℃避光，避免反复冻融。特别注意:由于本品是还原型的化合物，对氧气相当敏感，特别是在溶液中，为了保持产品的稳定性，产品分装后充氮气或者氩气等惰性气体以防止在冻存的过程中被氧化。

2.工作液的配制

本品MitoTracker Red CM-H2XRos是还原型的荧光探针，使用的工作液浓度比氧化型（MitoTracker Red CM-XRos）的浓度一般高3~5倍。以上推荐的浓度是针对氧化型MitoTracker Red CM-XRos，请使用本品（还原型）时进行适当的浓度调整。2）血清中可能含氧化酶，影响本还原型探针的稳定性，因此，不建议使用含血清的完全培养基稀释储存液。

3.染色及检测

3.1 贴壁细胞的染色

培养皿/板内加入适量的培养基覆盖盖玻片进行爬片培养。当细胞长至所需丰度，吸除培养液，加入37℃预热的MitoTracker Red CM-H2XRos染色工作液。在所使用细胞正常培养条件下孵育15-45 min（最佳孵育时间需优化）。染色结束后，使用新鲜培养液或缓冲液替换上述染色液，即可将其置于荧光显微镜下观察或荧光酶标仪下读数。或者进行后续的固定和透化步骤，见步骤4。

3.2 悬浮细胞的染色

离心收集细胞，吸除上清，利用37℃预热的MitoTracker Red CM-H2XRos染色工作液轻轻重悬细胞。在所使用细胞正常培养条件下孵育15-45 min（最佳孵育时间需优化）。染色结束后，离心收集细胞，利用37℃预热的新鲜培养液或缓冲液重悬细胞，被染色的细胞可用流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光显微镜进行分析。

如果需要盖玻片上固定化的细胞，那么可在铺片前先用多聚赖氨酸（poly-D-lysine）包被载玻片或盖玻片。 或者进行后续的固定和透化步骤，见步骤4。

4. 固定和透化

4.1 染色结束后，利用培养液或缓冲液清洗细胞。

4.2 小心吸走清洗液。换用新鲜配制且预热的含2-4%甲醛的缓冲液或培养液进行细胞固定。经验证，本染料MitoTracker Red CM-H2XRos由含3.7%甲醛的完全培养液于37℃孵育内皮细胞15min能起到良好的固定效果。

4.3 清洗细胞：吸除固定液，用适当缓冲液冲洗细胞数次。

4.4 细胞透化（可选）：

像ICC等实验需要细胞要做透化，则可将已固定的细胞直接加入含有去污剂如Triton X-100的缓冲液中孵育。透化结束后，用缓冲液清洗细胞即可进行后续ICC实验。经检测，利用含0.2% Triton X-100的PBS孵育内皮细胞10min可以达到良好的透化效果。另外，还可利用预冷的丙酮透化5 min，之后用PBS清洗细胞。经验证，即使后继没有进一步的抗体标记，丙酮透化处理也可降低背景信号。 

注意事项

1)  荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2) 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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