Fluo-3 AM, 细胞膜可渗透钙离子荧光探针

产品简介

Fluo-3, AM是最常用的检测细胞内钙离子浓度的荧光探针之一。它穿透细胞膜进入细胞后被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内，Fluo-3若以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，但是当它与细胞内钙离子结合后可以产生较强的荧光，最大激发波长为506nm，最大发射波长为526nm。实际检测时推荐使用的激发波长为488nm左右，发射波长为525～530nm。可以使用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化。

本品以50ug小包装的冻干粉形式，用于细胞内Ca2+水平检测时，推荐浓度0.5-5uM。

基本特性

CAS:121714-22-5 

同义名： 1-[2-Amino-5-(2,7-dichloro-6-hydroxy-3-oxo-9-xanthenyl)phenoxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N’, N’-tetraacetic acid, 

分子式：C₅₁H₅₀Cl₂N₂O₂₃ 

分子量：1129.85 

纯度：≥90%（HPLC） 

外观：红色粉末 

溶解性：溶于 DMSO（1-5 mM）

Ex/Em：525～530nm（Ca2+结合）； 

储存条件：置于-20℃干燥保存，1年效期。冰袋运输

使用方法

A 试剂准备

1）配制Pluronic F-127母液：称取100mg Pluronic F-127粉末（Cat No. FS0432）中加入500ul DMSO,配制成20%(W/V)母液。溶解过程需要在40-50℃加热20-30min.溶液室温保存，不用冷藏。如有结晶析出，可以重新加热溶解，不影响使用。

2）HHBS BUFFER(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer,pH7.3)或者其他生理缓冲液

B 操作步骤

1）用无水DMSO溶解Fluo-3,AM配制成1-5mM的储存液，或将已配好的Fluo-3,AM储存液取出于室温回温。（如：若配制成4mM的母液，需向50ug Fluo-3,AM中加入11.9ul无水DMSO）。

2）用HHBS或其他生理缓冲液Fluo-3,AM+DMSO储存液稀释到1-10uM的工作液，提前加入适量的20%Pluronic F-127溶液，使其终浓度为0.02%。

【注（1）】：Fluo-3,AM应用在大部分细胞的推荐加载浓度为4-5uM,具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得结果的基础上尽量使用最低探针浓度。

【注（2）】：Fluo-3,AM工作液需现配使用，避免反复冻存。

【注（3）】：Pluronic F-127可以防止Fluo-3,AM在溶液中聚合并促使探针更好进入细胞。但Pluronic F-127可降低Fluo-3,AM的稳定性，因此只建议在配制工作液时加入，不建议加入储存液长期保存。

3）【可选】如果细胞内含有机阴离子转运体，丙磺舒（Probenecid,1-2.5mM)或者，磺吡酮（Sulfinpyrazone,0.1-0.25mM）可能需要加入细胞培养基内，以降低去酯化探针的泄露。

【注（1）】：丙磺舒或磺吡酮储存液相当偏碱，因此加入培养基后需要重新调整pH。

4）将准备好的Fluo-3,AM工作液加入细胞，加入量以覆盖细胞为准。37℃或者室温孵育20-60min。

【注（1）】：关于孵育的时间，如果首次做实验不能确定，建议先孵育30min,看荧光效果；如果细胞死亡较多，适当缩短时间；如果荧光强度太弱，适当延长时间。

【注（2）】：降低探针加载温度可能会降低探针的区室化现象。

5）吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理缓冲液（如有必要，使用含转运体抑制剂如2.5mM丙磺酸的缓冲液）替换，去除多余探针。

6）用适当的仪器如激光共聚焦、流式细胞仪、荧光酶标仪等，用波长Ex/Em=494/516nm来进行检测。

【注（1）】：Fluo-3,AM进入胞内后，经酯酶降解形成Fluo-3，并不是以供价结合的形式滞留在细胞质内。因此不可对加载染料的活细胞进行固定处理，再进去Ca2+水平检测。

注意事项

1）荧光染料均匀在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2）乙酰氧基甲酯（AM）易吸潮，冰箱取出后请在干燥的环境放至室温后在开封。由于试剂微量，开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。

3）Fluo-3,AM在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管底、或管壁或管盖内，可在20-25℃温育片刻至全部溶解后使用。

4）Fluo-3,AM第一次使用，建议储存液现配现用，分装成单次用量，严格做到≤-20℃密封干燥冻存，以防止受潮。为了保证良好的实验效果，尽量在短时间内使用。

5）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

5）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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