RAW264.7；小鼠单核巨噬细胞白血病细胞

产品简介

收货注意事项

T25 细胞到货处理

观察：收到细胞后，请及时核对培养瓶上标注的细胞名称是否与订购的细胞名称一致以及培养瓶是否有破损或漏液等异常情况。

处理：

1）75%酒精棉球擦拭 T25 细胞培养瓶外部。

2）显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照保存（40x,100x,200x 各一张）前

三天照片为重要售后依据，不提供照片默认收到状态良好。

3）不要打开培养瓶盖，将细胞放入 37 度培养箱中静置 3-4 小时后再做处理，以稳定细胞状

态。

4）收到细胞后，及时查看说明书是贴壁细胞还是悬浮细胞形态，并按常规贴壁或悬浮细胞

的传代方法操作。

贴壁：未超过80%汇合度时，将瓶装的完全培养液收集至离心管中，留5ml完全培养基，

放入37℃、5%CO2孵箱培养；超过 80%汇合度时，根据情况传代或者冻存，具体操作见细胞

培养步骤。首次传代，建议 1:2 传代（两个 T25）。（传代时建议一瓶用原瓶里面的完全培养

基，另外一瓶用自己配的完全培养基，进行对比培养。）

备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。当密度达到80%左右， 传代比例前几次都按照1:2传代，传代后一个倍增周期后可以长成2瓶80%左右密度的细胞时，冻存其中一瓶成1个1ml的冻存管当种子细胞保存，另外一份长满的细胞继续1:2传代，反复操作后冻存细胞种子大约3个以上。 后续根据细胞倍增效率和密度可以适当扩大传代比例做实验。

传代比例：

1个T25瓶传2个6cm的培养皿或者2个T25瓶 相当于1:2

1个T25瓶传1个10cm的培养皿或者1个T75瓶 相当于1:3

冻存细胞到货处理

1）收到细胞后，检查外包装情况和箱内是否还有干冰。如有外包装破损干冰已完全挥发等

问题，请即时联系。

2）将细胞取出转移至液氮或-80℃度冰箱保存，建议尽早复苏。

细胞复苏、传代与冻存操作流程

1）冻存液：90%FBS或者完全培养基+10%DMSO 或者我司无血清冻存液（货号：FS1187/FS1188）均可

冻存发货的细胞  常规常见细胞 冻存管2只。我们建议客户先复苏1只，存活的话第二只当种子保存，第一只没有存活再严格按照我们的要求复苏第二只，如果还不成功 第一时间反馈细胞复苏的详细信息给我们。【注】：未与我方联系擅自复苏第二管出现问题不予售后。

操作流程：

复苏

1) 将恒温水浴锅中的水预热到37℃；

2) 准备一支15ml离心管，加入5ml含10%FBS的完全培养基，放入37℃水浴锅中预热；

3) 戴上护目镜，厚毛线手套后，从液氮罐中取出要复苏的细胞，尽快转入37℃恒温水浴锅中复温晃动冻存管以提高复温速率；

4) 将融化了的冻存管中的细胞吸入事先准备的离心管中，混匀后，1000rpm离心5min；

5) 准备一个T-25培养瓶，写上细胞名称、日期，再加入4ml完全培养基；

6) 离心完成后弃去上清，用1ml完全培养基重悬细胞后，转入T-25细胞培养中，混匀后转入CO₂培养箱中培养静置。

注意：从液氮中取出细胞冻存管时，若冻存管内有液氮进入，需拧松冻存管，排出内部残留的液氮，之后拧紧冻存管，置于干冰上，然后放入37℃水浴中，避免温差太大造成液氮快速气化而爆炸。

传代 （细胞传代建议一传二）

1) 当细胞汇合度达到85%以上时，可进行传代。

2) 在生物安全柜内，打开培养瓶瓶口，收集瓶内的培养基；

3) 向培养瓶内加入3ml无菌的1×PBS 后，水平放置培养瓶，使PBS能够浸润到培养瓶底面上所有的面积，吸弃PBS；

4) 向瓶内加入消化液1ml，浸润底面后放入37℃ CO₂培养箱中孵育1~2min；

5) 孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，若全部消化下来则直接向培养瓶内加入2ml含10%FBS的完全培养基中，将悬液吸入15ml离心管；

【注】：如还有部分细胞未消化下来，可采用分步消化：

① 准备一个无菌的15ml离心管，加入2ml含10%FBS的完全培养基；

② 将消化下来的细胞吸入①中的离心管内中和（避免吹打）；

③ 向之前消化的培养瓶中加入1ml胰酶继续消化2min左右（除贴壁非常牢固的细胞外。比如RAW264.7等消化时间可以长点，其他细胞尽量缩短消化时长，可以减少胰酶对细胞膜的损伤，有助于维持细胞系的状态持续稳定，降低老化速度），轻拍培养瓶，95%左右细胞脱落后加入2ml含10%FBS的完全培养基中和，中和后的细胞悬液移入①中的离心管内。

6) 1000rpm离心5min；

7) 准备两个新的T-25培养瓶，各加入4ml完全培养基。

8) 离心完成后，弃上清，用2ml完全培养基重悬离心细胞，将重悬后的细胞转入2个T-25培养瓶，每个培养瓶各1ml；

9) 水平放置培养瓶，震荡混匀后，将培养瓶置于37℃，5%CO₂培养箱中静置培养。

【注意】：

1）、每次消化不超过2min，如果消化2min后，培养瓶中还有较多细胞贴壁，可采用分步消化，将消化下来的细胞移入15mL离心管中和，再向培养瓶中加入胰酶继续消化，每次消化不超过2min，直到完全消化下来为止。

2）、细胞传代建议1传2，前期传代后冻存一份细胞，另外一份细胞继续扩增，确保细胞种子保留好之后可以扩大传代比例。

3）、特殊细胞贴壁特别牢固的也可以采用长时间消化法或者物理细胞铲（刮）把细胞消化或者刮下来，比如巨噬类细胞。

4）、有一些细胞属于半贴壁生长，收货后一部分贴壁，还有一部分悬浮的情况下，注意不要把悬浮的细胞全部抽掉不要，或许还是活细胞，应该根据密度数量情况决定是否需要收集起来和贴壁一重新铺瓶。

冻存（细胞冻存建议每瓶T25冻一支）

1) 将需要那冻存的细胞从CO₂培养箱中取出，在生物安全柜内，打开培养瓶瓶口，吸弃瓶内的培养基；

2) 向培养内加入无菌1×PBS 3ml，之后水平放置培养瓶，旋转震荡培养瓶，使PBS能够浸润到培养平面上所都的面积，吸弃PBS；

3) 重复步骤2一次，之后向瓶内加入消化液2ml，轻微震荡后放入37℃ CO₂培养箱中孵育1min左右；

4) 孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，如还有部分细胞未消化下来，可在生物安全柜内用移液管吸起消化液，吹打培养平面；

5) 向消化下细胞的培养瓶中加入3ml含10%血清的完全培养基终止消化，然后将培养瓶中的液体转入15ml离心管中，300g离心5min；

6) 离心完成后，弃上清，用1mL冻存液重悬细胞沉淀，然后转入1.8ml冻存管中；

7) 将冻存管转入填充满异丙醇的程序降温盒中，之后转入-80℃冰箱中过夜降温；

8) 第二天，取出降温完成的序降温盒中的冻存管，尽快转入液氮罐中保存。

注意事项

（a）在细胞生长的初始阶段，细胞以贴壁的形式生长并呈现出长方体的形态和有“伪足”延伸。随着培养时间的增加，细胞呈现圆形并以叠加的形式生长。细胞密度达到一定的程度，会有细胞以悬浮的方式散落到到培养基中，镜下观察会发现悬浮和贴壁的细胞会同时出现。

（b）该细胞形态上包含松散贴壁的纺锤形和圆形或者立方形。当细胞密度较大时，细胞会轻微脱落变圆或者许多细胞堆积在一起，有些细胞甚至脱落漂浮。这些漂浮的细胞是存活的，在传代时应收集起来，离心后细胞沉淀可以继续培养。

（c）血清质量差异可能引起细胞贴壁能力变化，应选用高质量的胎牛血清。