PKH26红色荧光细胞链接试剂盒

英文名 PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit for General Cell Membrane Labeling
产品编号 FS1312
产品分类 荧光探针及染色
纯度 储存条件 2-8℃
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产品简介
    PKH26是一种专利的膜标记探针,结构上带有-长脂肪族尾巴,能稳定插入细胞膜脂质区域。PKH26荧光处于黄橙色光谱区间(见图1) , 最大激发波长为551nm,最大发射波长是567nm ,与罗丹明或PE检测系统兼容。也可能用标准荧光素( Fluorescein)激发滤片,但荧光强度可能会有些降低。PKH26 最长的体内半衰期,超过100

本产品PKH26荧光细胞连接试剂盒采用拥有专利的膜标记技术,专利膜标记技术,稳定的与细胞膜脂质区结合并发出红色荧光,染色方式依赖于细胞与膜的类型,主要用于细胞体外标记、体外细胞增殖研究及体内外细胞示示踪研究。

1

自备材料

1、充分分散的单个细胞悬

2、含血清的组织培养基(完全培养基)

3、Ca2+Mg2+和血清的培养基或者缓冲盐(如Dulbeccos PBSHanks BSS

4、血清,白蛋白或其它组织兼容性蛋白

5、离心管(4-15mL

6、温控离心机(1,000×g

7、荧光分析设备(荧光读板机,荧光或共聚焦显微镜,流式细胞仪)

8、层流罩

9、血球计数板或细胞计数器

10、载玻片和盖玻片

操作方法(下列过程最终体积为2mL,含2uM PKH26,以及1×107cells/mL细胞浓度)

以下过程均在室温下进行(20-25
1. 2×107个细胞于离心管中,用不含血清培养基洗一遍。

注意血清蛋白和脂质会与染料结合,降低与细胞膜结合的染料浓度。最好在用稀释液C重悬细胞染色前(第四步)用无血清培养基或缓冲液洗细胞一次(第一步)。

2. 400×g离心5分钟。注意PKH26染料不能直接加到离心沉淀中,这样会造成细胞染色不均一和细胞活力降低。

3. 离心后,小心吸弃上层清液,剩余上层细  胞液体积不超过25μL

注意为得到可重复的实验结果,在用稀释液C重悬时,减少残留培养基或缓冲液体积非常重要。

4. 加入1mL稀释液C用移液管轻轻吹打混匀,制备  2×细胞悬液。不要用振荡器震荡,不要让  细胞在稀释液C中保存太长时间。

注意生理盐(physiologic salts)的存在会使得染料结团并大幅降低染色效率。因此,需确保染色时细胞悬浮于稀释液C中,不含培养基或缓冲盐。

5. 临染色之前,将4μL PKH26乙醇溶液加  1mL稀释液C中,充分混匀,配制的  2×染色液(4×10-6M)。

注意①】:为减少乙醇对细胞活率的影响,步骤5加入的染料使得步骤6中乙醇最终浓度不能超过1-2%

注意②】:如果所需染料最终浓度<2×10-6M,需用100%乙醇将PKH26稀释于另一单独的容器中,以确保实验结果的可重复性。

6. 快速将1mL 2×细胞悬液(步骤4)加入  1mL 2×染色液(步骤5)中,立即用移液  管混匀。最终细胞浓度为1×107/mLPKH26浓度为2×10-6M

注意:由于染色瞬间完成,快速将细胞与染料混匀对得到明亮、均匀和可重复的标记结果非常重要。下列措施有助于得到较优的结果:

a.不要将PKH26染料直接加入含细胞的稀释液C中。

b. 细胞悬液(步骤4)与染色液(步骤5)等体积混合。

c. 调整细胞和染料的浓度避免染色  体积太小(<100μL)或太大(>5mL)。

d. 用电动移液器快速将细胞和染料混匀。  血清移液管混匀速度太慢而使得染色不  均匀。Racking和旋涡震荡混匀同样混匀  较慢,染色均一性较差。

e. 分配体积尽量准确,以保证样品与样品  之间,实验与实验之间的可重复性。

7. 混匀后的染色的细胞孵育1-5 min。由于  染色速度较快,延长孵育时间对实验没有帮助。

注意:让细胞在染色液中停留尽量短的时间,同时保证得到理想的染色强度。因为稀释液C缺少生理性盐,过长时间的暴露在稀释液C中会造成某些细胞活力降低。如果不能确定其影响程度,可增加仅作稀释的对照组和只用乙醇而不用染料染色的对照组。

8. 加入等体积的血清(2mL)或其它合适的蛋白溶液(如1% BSA)终止反应,孵育1min以结合多余的染料。

注意①】:血清(或等效的蛋白浓度)为最优的终止液。如果用完全培养基替代,添加体积为10mL

注意②】:不要通过加稀释液C或离心来终止反应。

注意③】:不要用无血清培养基或缓冲盐,他们会使染料产生聚集。染料聚集使清洗过程中无法洗净,使得分析过程中仍存在未标记的细胞。

9. 将细胞在20-25℃条件下400×g离心10min,小心吸弃上清。用10mL完全培养基重悬,将重悬液转移至另一新的无菌离  心管中,20-25℃条件下400×g离心5 min。用10mL完全培养基再清洗两遍以除去没  结合的染料。

注意①】:将重悬液转移至新离心管中,减少了离心管壁残留的染料对洗涤效率的影响;

注意②】:不要用稀释液C清洗。

10. 最后一步清洗后,用10mL完全培养基重悬细胞评估细胞回收率,细胞活率和荧 光强度(图2。离心重悬细胞至所需活细  胞浓度。

注意①】:染色后的细胞可以用中性甲醛固定,避光条件下,荧光强度至少3周内保持稳定。

注意②】:染色荧光强度一般为背景的100-1000倍。虽然染色的CV值与细胞种类有关,但荧光分布应该尽量均匀对称。

2. PKH26染色优化

11、MC-38 TIL细胞用上述指定PKH26浓度染色,最终细胞浓度为1×107/ml。活力()由FITC染色测定,平均荧光强度()用流式细胞仪检测。用20μM PKH26标记后,抗肿瘤TIL特异性和效能没有改变。

 

运输和保存方法
冰袋运输。2-8℃保存,有效期1年。PKH26乙醇溶液冷藏保存。保证染料乙醇溶液瓶盖盖紧减少蒸发以防止染料浓度升高。

 

注意事项

1、亲脂性染料结合到细胞膜上完成标记。染色强度是染料浓度和细胞浓度的函数,与渗透性无关。因此,保证染料添加量不过量非常关键。过标记的细胞将会导致细胞膜完整性缺失或降低细胞活性。

2、本品可用于体内体外细胞的标记,包括干细胞、淋巴细胞、单核细胞、内皮细胞、神经细胞或者任何其他细胞。体内细胞的标记过程需一定的改进,如血小板的染色,或者选择性标记吞噬细胞。

3、本品染色过程中细胞浓度和染料浓度代表操作的起始浓度。该浓度被证明适用于多种细胞。使用者需通过评估染色后细胞活率(如,PI染色)、荧光强度、染色均匀度及是否对所研究细胞功能有影响等,根据实验目的,确定最优的染料浓度和细胞浓度。

4、虽然贴壁细胞也可以染色,但单个悬浮细胞染色均一性更佳。因此用蛋白酶(trypsin/EDTA)将贴壁细胞消化成单个悬浮细胞后再染色效果更佳。

5、PKH26染色过程中,不能存在叠氮化物或代谢毒性物。

6、荧光染料均存在淬灭问题,请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭。

7、该染料避光保存,使用前观察是否有结晶。如出现结晶,室温防止30min,然后超声或震荡直至溶解

 

8、稀释液C可室温或冷藏保存。如果冷藏保存,使用前复温至室温。稀释液C为无菌溶液,不含任何防腐剂和抗生素,其需保持无菌。不要将染料储存于稀释液C中。溶于稀释液C的工作液需现配现用,且配好后需立即使用。

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