罗丹明标记鬼笔环肽

英文名 TRITC Phalloidin
产品编号 FS0381
产品分类 荧光探针及染色
纯度 储存条件 -20℃
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产品简介

鬼笔环肽(Phalloidin)是一种来源于毒蕈类鬼笔鹅膏(Amanita phalloides)的环状七肽毒素,以高亲和力(Kd= 20 nM)选择性结合于丝状肌动蛋白F-actin,而不会与单体肌动蛋白G-actin结合,通常用来标记组织切片,细胞培养物或无细胞体系中的F-actin,从而对F-actin进行定性和定量分析。另外,鬼笔环肽衍生物也以相近的亲和力结合于大小纤维,无论是动植物来源的肌肉细胞或非肌肉细胞,按照每一个肌动蛋白亚基约与一个鬼笔环肽分子的计量比结合。且非特异性结合几乎可忽略,染色区域和非染色区域辨识度非常明显。因此,鬼笔环肽衍生物特别适合替代肌动蛋白(Actin)抗体进行相关研究。另外鬼笔环肽衍生物很小,直径约12-15Å,分子量<2000 Daltons,未标记肌动蛋白(Actin)的许多生理特性都得以维持,比如,同肌动蛋白结合蛋白如肌球蛋白,原肌球蛋白,DNase I等仍能发生反应;鬼笔环肽标记的纤维丝仍可穿透固相肌球蛋白基质;以及甘油抽提的肌纤维标记后仍可收缩等。本品为TRITC(四甲基异硫氰酸罗丹明)标记的鬼笔环肽,染色反应特异性强,对比性高,具有比Actin抗体更好的染色效果,适合用作F-actin的定性和定量检测。另外,经本品结合后的F-actin仍能维持actin自身具有的许多生物学特性。且本品的结合没有物种差异性,适用性广泛。

分子式

C60H70N12O13S2

分子量

1231.4

最大激发/发射波长(Ex/Em

540546/565575nm

多肽序列

TRITC-bicyclic(Ala-DThr-Cys-cis-4-hydroxy-Pro-Ala-2-mercapto-Trp-4-hydroxy-5-amino-Leu)(S-3 to 6)

外观

紫色液体

溶解性

溶于DMSODMF、甲醇或者乙腈水溶液(20%

操作步骤

1.  工作液准备:对于TRITC标记鬼笔环肽。本品以溶于甲醇的20µM储存液形式提供,总量为300µl。按照100 nM的工作液浓度来换算,可制备总量为60 ml的工作液。建议收到产品后,根据单次使用量,对母液进行小量分装,-20℃避光冻存,一年稳定。

开始实验前,使用1×PBS缓冲液稀释储存液到需要的工作浓度。推荐工作浓度为:80~200nM。工作液现配现用。按照100nM浓度来计算,可进行300次细胞染色。

2.  染色步骤

1:细胞爬片生长24h,使其密度达到50%汇合度。

2:吸掉培养液,37℃预热的1×PBSpH 7.4)清洗细胞2次。

3:使用溶于PBS4%甲醛溶液进行细胞固定,室温固定10min。 【注意】:避免固定剂中含有甲醇成分,因为甲醇在固定过程中可能破坏肌动蛋白。

4:室温条件下,用PBS清洗细胞2~3次,每次10min

5:室温条件下,用丙酮(≤-20℃)脱水或者用0.5% Triton X-100溶液透化处理5min

6:室温条件下,用PBS清洗细胞2~3次,每次10min

7:取200µl配制好的TRITC标记鬼笔环肽工作液,覆盖住盖玻片上的细胞,室温避光孵育30min(通常情况下,4~37℃孵育皆可)。 注意:为了降低背景,可于TRITC标记的鬼笔环肽工作液内加入1% BSA;另外,孵育过程中为了避免溶液挥发,可将盖玻片转移到一个密封的容器内。

8:用PBS清洗盖玻片3次,每次5min

9:使用200µl DAPI溶液(浓度:100 nM)对细胞核进行复染,约30s

10 PBS清洗盖玻片,然后倒置在已经滴有一滴Fluoromount-GTM 水溶性封片剂的载玻片上。使用纸巾轻轻檫掉多余封片剂,然后用指甲油永久封片。此法制备的标本玻片可置于4℃避光保存,通常6个月内可继续做F-actin染色分析。

11 荧光显微镜或者共聚焦显微镜下进行荧光观察,选择TRITC激发/发射滤片(Ex/Em=545/570nm)和DAPI激发/发射滤片(Ex/Em=364/454nm)。

注意事项

1)鬼笔环肽具有毒性,需小心操作(对人的半数致死剂量LD502mg/kg)。

2)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

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